内源性血管生成抑制因子arresten基因的克隆、表达、纯化及活性的测定

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1、山西医科大学硕士学位论文内源性血管生成抑制因子Arresten基因的克隆、表达、纯化及活性的测定姓名：唐海英申请学位级别：硕士专业：卫生毒理学指导教师：郑金平20060516一曼，一!里堕堕翌查堂塑±堂些篓苎内源性血管生成抑制因子Arresten基因的克隆、表达、纯化及活性的测定摘要目的：构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体，优化表达条件，初步探讨表达蛋白的抑制血管活性。方法：从GenBank库中查找Arresten基因并获取其基因序列及蛋白序列，用DNAman软件设计引物。从健康产妇胎盘组织中提取

2、人总RNA，经逆转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因，低熔点琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化，纯化产物和质粒pBV220连接，并转化EcD『fJMl09、DH5a、BL21、BL21(DE3)感受态细胞，在氨苄阳性平板中筛选阳性菌落。重组质粒用PCR法和三种限制性内切酶BamHI、EcoRI和PvuII(基因序列155位的酶切位点)酶切进行鉴定，并进行序列测定，命名为pBV220．Art。构建的重组质粒pBV220．Art转化到宿主菌——EcoliJMl09、DH5a、BL2l、BL2l(DE3)中进

3、行原核表达。经SDS．PAGE凝胶电泳图条带分析，并结合湿菌重筛选出最优表达菌种，进行培养温度、培养时问、表达温度、表达时间及溶解氧量五方面表达，确定最优表达体系；超声破菌，分离得到包涵体，并对其进行洗涤纯化复性，考马斯亮蓝法测定蛋白含量；鸡胚绒毛尿囊膜实验观察新生血管生长抑制情况。结果：成功筛选出Axresten基因，通过测序结果表明在第132、148、200、236位基因序列不同；通过成功构建的重组质粒pBV220．Air，在EcoliJMl09、DH5a、BL21、BL21(DE3)中均表达出Arresten蛋白，S

4、DS-PAGE显示表达产物分子量约为26KD，表达产物主要以包涵体形式存在：通过优化表达，结果在E∞矗BL21(DE3)中30℃培养4h，42℃诱导表达4h，溶解氧量比例在1：5时表达量达到最高，表达量约占全菌蛋白的25％以上：进一步纯化表达，用2mol／L尿素、2％的TritonX-100溶液和1M的蔗糖溶液，及少许的EDTA洗涤效果最好，表达量约占全菌蛋白的40％以上，用梯度稀释法复性得到Arresten蛋白：经活性分析证实初步复性的A_rresten蛋白与阴性对照组比较统计学上有显著性差异，证明其有抑制新生血管生成的

5、作用。结论：应用基因工程技术，成功筛选出Arresten基因，并构建了原核表达重组体pBV220．Arr；通过优化表达，得到最优表达菌种coliBL21(DE3)及最优表达条件，能高效表达重组AiTesten蛋白；经过用尿素与Tritonx．100及蔗糖溶液综合方法洗涤纯化，纯化效果最好并获得了较纯的AiTesten蛋白；经过CAM试验证明，该蛋白具有良好的抑制新生血管生成的活性：Arresten蛋白具有良好的应用前景，通过对mrresten蛋白的研究，为进一步大规模高效表达和纯化AITCStcn目的蛋白提供了可靠的实验方

6、法，也为肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。关键词：Arresten，原核表达载体，基因克隆表达，功能测定山西医科大学硕士学位论文Cloning，expression，purificationofendogenousangiogenesisinhibitorArrestengeneanditsbiologicalactivitydetectionAbstractobjecfive：Inordertoconstructprokaryoticexpressionvectorforendogeneticangiogenesisinhi

7、bitorArrestengeneandtooptimizetheexpressioncondition，inthesametimetoinvestigateinitiallytheanti·bloodvesselactivityoftheexpressingprotein．Methods：AccordingtothemRNAsequenceandproteinsequenceofArrestengenefromtheGenbank，specificprimersforPCRweredesignedbyusingtheso

8、ftwareDNAman．ThetotalRNAwasextractedfromahealthypuerpera’Splacentaorganizeofthenormalpuerperal，andhumanArrestengenewasamplifiedbyreversetranscription·po