衣原体蛋白酶样活性因子(cpaf)的克隆、表达及纯化

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1、衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的克隆、表达及纯化王飞　朱庆三苗旭漫胡宁宁李霄金宁一【摘要】目的构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体，经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白，研究其生物学功能。方法从病料中克隆得到CPAF的原始基因，将PCR产物经纯化连接到pMD18T，将重组质粒pMDCPAF经NdeI和BamHI双酶切，与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接，建立pET42b(+)CPAF表达载体，阳性克隆经鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，经亲和纯化、离子交换纯

2、化、分子筛纯化融合蛋白，进行SDSPAGE分析，HC)所必须的转录因子，例如：调节因子X5(RFX5)和上游刺激因子1(USF1)，来达到抑制MHC合成的作用〔1〕。人类受到衣原体感染时，CPAF特异性抗体效价明显高于外膜蛋白(MOMP)和热休克蛋白60(HSP60)，这说明CPAF具有良好的免疫原性。同时，人体内针对CPAF的抗体具有良好的中和效应，并能够有效保护机体免受感染，具有抑制衣原体感染的效果〔2〕。种种迹象表明CPAF极有可能成为潜在的衣原体免疫原，运用到将来的疫苗开发中。本研究选择对CPAF进行全

3、序列基因克隆，并在不同的载体系统中表达CPAF，获得可溶性蛋白，同时摸索出能够大量制备高纯度蛋白的纯化方法，为下一步应用奠定良好的基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1菌株与载体表达载体pET42b(+)载体及工程菌BL21(DE3)由本研究室保存;pMD18Tvector购自大连宝生物公司。　　1.1.2病料沙眼衣原体分离于病人组织。　　1.1.3主要试剂工具酶均购自大连宝生物公司，常用试剂及质粒提取试剂盒购自Sigma公司;PCR纯化及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxi

4、od公司。其他生化试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1模板的制备按照细菌基因组提取方法改进提取，在第5步之后将上清加入Sigma试剂盒中的柱子，其后步骤按照Sigma质粒提取试剂盒说明书操作。　　1.2.2PCR引物设计应用Primer5.0设计引物，由大连宝生物公司合成。CPAF上游引物5＇GCCCGGCATATGCTCCTGTACAAGGAG3＇(引入NdeI位点)，下游引物5＇CTTGGGATCCAAAACTACCATCTT3＇(引入BamHI位点)。　　1.2.3目的基因扩增按如下程序进行P

5、CR循环：95℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，共循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物的纯化按照Qiagen公司PCR纯化试剂盒说明书进行。　　1.2.4基因克隆将PCR产物经纯化连接到pMD18T后转化工程菌JM109。用PCR、双酶切筛选阳性克隆，阳性重组子命名为pMDCPAF，送公司测序。　　1.2.5构建表达载体将pMDCPAF用NdeI和BamHI两种酶同时消化，得到目的基因CPAF。目的基因纯化按照Qiagen凝胶回收纯化试剂盒说明书进行。将CPAF与用相同酶消

6、化的原核表达载体pET42b(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布含有卡那霉素(50mg/L)的固体培养基，经PCR、酶切进行阳性克隆筛选，将阳性重组子命名为pET42b(+)CPAF。　　1.2.6诱导表达挑取阳性单克隆，接种于2mlLB/Kanr液体培养基中，37℃摇床，250r/min过夜培养。次日以1∶100比例接种至200mlLB/Kanr液体培养基中，37℃250r/min培养至OD600=0.6～1。加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，37℃诱导5h后，4000r/mi

7、n离心10min收集菌体，用40mlTE缓冲液将沉淀重悬，超声波破碎裂解菌体，离心后收集上清，用于检测可溶性表达。　　1.2.7SDSPAGE凝胶电泳检测常规制备13%分离胶和4.5%浓缩胶电泳，考马斯亮蓝染色后用凝胶扫描影像系统拍照，并用系统软件分析蛋白含量同时确定目的蛋白分子量。　　1.2.8CPAF的亲和纯化将破碎上清液用0.45μm滤膜过滤后加至经0.02mol/LTris缓冲液(pH8.0)平衡好的Ni2+柱，用含有0.015mol/L咪唑的0.02mol/LTris缓冲液(pH8.0)洗去未结合的杂蛋白，

8、然后用含有0.25mol/L咪唑的0.02mol/LTris缓冲液(pH8.0)将CPAF蛋白解离下来。　　1.2.9CPAF的离子交换纯化采用蛋白液相层析纯化(AKTA)系统进行纯化，阴离子纯化柱采用SourceQ，溶液A为不含NaCl的0.02mol/LTris缓冲液(pH8.0)，溶液B含1mol/LNaCl的0.02mol