β-防御素克隆表达纯化抗菌活性论文.doc

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1、B-防御素克隆表达纯化抗菌活性论文p-防御索克隆表达纯化抗菌活性论文【提示】木文仅提供摘要、关键词、篇名、日录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。【摘要】防御素不仅作为抵御微生物入侵的第一道屏障在肠道屮发挥垂要作用，而且也是一种先天免疫系统的重要组成部分。防御索是一类平均分子量为3.5〜6kDa的具有广谱抗菌活性的短肽,通常由29〜54个氨基酸组成，富含半胱氨酸和粘氨酸，农现出较强的阳离子特性与热稳定性，是天然宿主识别微生物的基础。防御素的生物活性多样,具有广泛杀菌活性，对

2、细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种微生物都具有杀伤作川，还具有细胞毒性和免疫细胞有趋化功能•调节机体的免疫系统。根据斑马鱼(Daniorerio)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)beta-defensin-1ike2(defbl2)mRNA(GenBank序列号NMOO1081554.1,NM001195168.1)和石斑鱼的beta-defensingene(GenBank序列号：JN698964.1),进行序列的多重对比，发现三个序列具有高度同源性，设计特异性引物，以草鱼肠道总RNA为模板，通过RT-PCR方

3、法扩增出了160bp草鱼P-防御索的基因，对防御素基因进行克隆并对克隆载体及pET-32a载体双酶切后进行连接，构建了高效原核表达载体pET32-GBDo将重组质粒转化入人肠杆菌表达菌BL21中进行表达,SDS-PAGE电泳和WesternBlot分析表明GBD重组蛋门分子址人约为22kDa,并具有抗原性。通过Ni2+亲和层析方法纯化GBD重组蛋门，蛋门纯度均在95%以上。而经肠激酶酶切以后的重组防御素只有5KD,对其抗菌活性和GBD抗菌谱进行了分析,发现其对沙门氏菌、嗜水单胞菌、巴氏杆菌、人肠杆菌、链球菌、金黄色筒萄球

4、菌、鱼害粘球菌都肓明显的抑制作用。证明草鱼肠道B-防御素具有广谱抗菌活性，对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌均有抗菌效果。【关键词】草鱼；—防御素；克隆；表达；纯化；抗菌活性；【篇名】草鱼肠道P-防御素克隆表达及抗菌活性分析【口录】草鱼肠道防御索克隆表达及抗菌活性分析4一5Abstracts第一章前言10-211.1动物防御素10-1311-12摘要1防御素的1.1.1分类和结构特征10-14a-防御素11素12-1313-1414-1515-17用17-18作用机理181.1.30-防御1.3植物类防御索2.1抗细菌活性

5、2防御素的生物学活性2.2抗病毒活性1514-182.3免疫学活性1.5抗真菌作2.4细胞毒作用和抗肿瘤作用173防御素的作用机理182.1防御素抗细菌的4防御3.2防御素抗病毒的作用机理183.1防御素在医学中的应用18-19索的应用前景18-2118-194.1.1防御素治疗肺部疾病4.1.2防御素治疗黏膜疾病1919-204.2防御素的临床药用研究第二章草1实验1.21.4接头4.3防御素在畜牧业小的应用20-21鱼肠道3-防御索的分子克隆与重组载体的构建21-36材料与设备21-23主要设备与仪器21-22与引物

6、22-231.3试剂与试剂盒222实验方法23-322.1动物材料处理23测242.2总RNA的提取23-242.3RNA含量和纯度的检2.5草2.4草鱼肠道B-防御素的RT-PCR24-25鱼肠道P-防御素基因PCR扩增25252.7PCR产物的提纯252.9TA克隆26-272.6DNA核酸电泳检测2.8CaCl_2法制备感受态细2.10PCR检测28-292.12DNA定胞25-2627-28量2929-302.11pMG-T-GBD质粒的提取2.13pMG-T-GBD和pET32a(+)载体的双酶切2.14酶切产

7、物的冋收与纯化302.15GBD与pET32连接反应30-31门斑筛选31：312.16重组质粒pET32-GBD的转化利蓝2.17重组质粒pET32-GBD的PCR鉴定2.19重组质2.18重组质粒pET32-GBD的提取3131-32粒pET32-GBD的酶切鉴定322.20重组载体pET32-GBD的测序3结果与分析32-35RT-PCR扩增32-33332.2克隆载体pMG-T-GBD的酶切鉴定4.1.3重组质粒pET32-GBD的PCR和酶切鉴定33-35第三章草鱼肠道卩-防御素的高效表达及抗菌活1实验材料与设

8、备36-371.2主要设备与仪器36-372实验方法37-42讨论35-36性分析36-49菌种36371.1实验动物、1.3试剂与试剂盒2.1草鱼肠道P-防御素的诱导2.3草鱼肠道P-防表达37-382.2细菌超声破碎38御素表达蛋门的SDS-PAGE检测38组蛋门的纯化38-392.4草鱼肠道P-防御索重2.5草