牦牛中性粒细胞防御素的分离纯化及抗菌活性

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1、牦牛中性粒细胞防御素的分离纯化及抗菌活性董开忠,余四九,杨具田,王冬梅,蔡勇,雒晓芳【摘要】　　目的:分离牦牛中性粒细胞(PMN)防御素并检测其抗菌活性。方法:运用Percoll密度梯度离心法,从新鲜牦牛全血中分离纯化牦牛中性粒细胞,用50mL/L冰乙酸抽提,提取液经BioGelP10聚丙烯酰胺凝胶过滤和反相高效液相色谱（RPHPLC）分离纯化,对活性多肽进行质谱分析,并对其中3个肽进行氨基酸组成分析,用琼脂弥散法检测三种多肽的抗菌活性。结果:获得13种活性多肽,其中三个肽为牦牛中性粒细胞防御素1～3,并具有很强的抗菌活性。结论:PMN存在防御素并具有广谱抗菌活性,在天然免疫中发挥

2、着重要作用。【关键词】牦牛;分离纯化;中性粒细胞;防御素　　〔Abstract〕AIM:ToisolateandpurifyβdefensinfromtheneutrophilsofYak.METHODS:ThemethodofpercollgradientcentrifugationployedtopurifyneutrophilsfromYakperipheralblood.ThecrudeextractionfromYakneutrophilsL/Laceticacid,acidsolubleextractofYakneutrophilsidegelfiltrationandRP

3、HPLC,and9outof22apicesshoassspectrograph.Theantibacterialactivitiesoftheextractsfromeverystepolecularinedtobe4.2,4.6and4.8kDabymassspectrograph.BNBD13fromYakneutrophilsantimicrobialactivity,Yakdefensinhasanimportantpartininnateimmunit.　　〔Keyond等〔5〕于1991年首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现,在哺乳动物的上皮细胞和嗜中性粒细胞内广泛表达。

4、成熟的β防御素由38～42个氨基酸残基组成,分子内含有6个保守的半胱氨酸,序列中部有一个保守的脯氨酸和一个甘氨酸,6个半胱氨酸形成三对由Cys1Cys5、Cys2Cys4、Cys3Cys6方式连接的二硫键〔6〕。研究表明防御素在体外对革兰阳性菌、革兰阴性菌、分枝杆菌〔7〕、真菌〔8〕、部分被膜病毒〔9〕和肿瘤细胞等均具有很强的杀伤活性,同时具有免疫激活、连接先天性免疫与获得性免疫〔10〕,以及对炎症、创伤及神经损伤的修复等作用〔11〕。其作用研究已引起科研工作者的广泛关注。牦牛是我国高原地区的特有动物资源品种之一,具有耐氧、御寒、强抗病的生理特性。目前有关家畜、豚鼠、家兔和人的中性

5、粒细胞防御素在国内外已有报道,而对牦牛中性粒细胞（Polymorphonuclear,PMN）防御素的研究尚未见报道。本研究旨在从PMN分离出具有抗菌活性的小分子多肽,并对其抗菌活性进行研究,以便对其结构与功能进行更深入的研究。　　1材料和方法　　1.1材料　　成年雄性牦牛由天祝藏族自治县回民屠宰场提供,金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(ATCC25922）、枯草芽孢杆菌(ADB403)均由本中心保存;Percoll分离液、三氟乙酸为Sigma产品,BioGelP10为BioRadLaboratories产品,乙腈(Merck公司),抗菌肽indolicidin(牛)购自美

6、国肽公司,冰醋酸(分析纯)为南京化学试剂厂产品。　　1.2方法　　1.2.1PMN的获取　　用无菌方法采集牦牛新鲜血液(EDTA抗凝)800mL,用比重1.086～1.115的Percoll密度梯度离心液分离全血中的中性粒细胞,获取的多形核细胞层用等渗盐水洗涤3次后,进行细胞计数并计算活细胞率。　　1.2.2牦牛中性粒细胞酸提取物的制备　　将纯化的中性粒细胞在0.34mol/L冷蔗糖溶液中匀浆,然后将细胞匀浆液离心,1500r/min离心10min,沉淀物用上述蔗糖液洗涤并再次离心1～3次,收集上清液。上清液经17000r/min,4℃离心30min,淡黄色沉淀物即为中性粒细胞胞质内的颗

7、粒组分。然后将中性粒细胞颗粒组分加入50mL/L冰醋酸,在2～4℃环境中搅拌过夜（18～24h）,之后经17000r/min,4℃离心30min,收集上清液浓缩至相当于2.0×1012/L备用,蛋白浓度约为30g/L。冻干备用。　　1.2.3BioGel聚丙烯酰胺凝胶过滤纯化　　将冷冻干燥的PMN提取物溶解于5mL去离子水中,根据A值调整稀释度,使A为200,上样于柱体积为2.6cm×100cmBioGelP10的层析柱,用5