一种核苷嘧啶类抗真菌抗生素的分离纯化及抗菌活性的研究

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1、摘要近年来，深部真菌感染疾病的感染率逐渐提高，对患者的健康和生命造成了很大的威胁。课题组筛选得到一株芽孢杆菌，能产生核苷嘧啶类抗真菌抗生素，对引起深部真菌感染的白色念珠菌具有很好的抑制作用。论文在研究该抗生素发酵工艺基础上，重点研究该抗生素的分离纯化工艺，为该抗生素的进一步开发和利用奠定了基础。本论文首先对该抗生素的摇瓶培养工艺进行了优化，确定了较优的发酵条件：pH6．5，接种量8％，转速200r／rnin，装液量40mL／250mL，28。C下摇瓶发酵48h后产抗水平最高达到940．35U／mL；进一步在通气搅拌罐中进行了放大，在摇瓶得到的优化条件的基础上，在通气量为2wm，

2、搅拌转速200r／min，装液量60％(V／v)条件下，培养36h后产抗水平达到最高，达到950．5U／mL，比摇瓶培养略有提高。论文对抗生素发酵液的理化性质作了简单的考察，结果表明：该抗生素具有较强的热稳定性；在酸、中性环境下比较稳定，碱性环境下不稳定；低温条件下(．20oc)，该抗生素发酵液放置时间在9天以内均可保持较高的活性；该抗生素对光照不敏感；是一种极性酸性水溶性抗生素。在以上研究基础上，论文重点研究了该抗生素的分离纯化工艺条件。本论文建立的抗生素分离工艺为：发酵液絮凝预处理一调发酵液pH2．0--'H41大孔树脂脱色一HD．8离子交换树脂纯化一(制备高效液相精制)一

3、冻干。通过对工艺条件的优化，实现该抗生素的分离和纯化。本工艺路线首先采用了壳聚糖絮凝除菌，优化后的条件为：pH2．0、絮凝剂用量为0．4g／L、温度为30。C，絮凝率达到84．6％；以草酸和盐酸为沉淀剂，分别在pH4．0和2．0下沉淀发酵液中的金属离子和杂蛋白；大孔吸附树脂H41对发酵液进行脱色，脱色条件为：pH为2．0的发酵液以2BV／h的流速上柱，脱色率达到95．1％，抗生素效价提高到2332．18U／mL；选取了阳离子树脂HD．8作离子交换层析实验，优化后的工艺条件为：pH为2．0的上柱液以2BV／h的流速上柱，在吸附达到平衡后用去离子水冲洗后，再用0．6mol／L的NH

4、3．H20以4BV／h的流速洗脱。洗脱液减压蒸馏，冷冻干燥，得到淡黄色粉末，效价提高到5855．5U／rag。整个分离过程的总收率为63．4％。HPLC检测离子交换分离得到的产品，归一法测定其纯度为70．24％；抗生摘要素粗品经制备HPLC精制后，纯度达到95．75％，最终效价达到8280．5U／rag。经质谱分析，其分子量为520．68。紫外扫描发现该抗生素在298nm处有强吸收峰。对酵母类真菌具有较好的抑菌效果，抗生素粗品对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)为0．1807gg／mL。关键词：抗真菌抗生素发酵离子交换IIAbstractInrecentyears，theinf

5、ectionofdeepfungusincreasesgradually，whichthreatenssufferers’healthandlives．AstrainofBacilluswhichcanproduceakindofpyrimidinenucleosideantifungal—antibioticwasscreened．ThismaterialhashighantifungalactivityagainstCanidiaalbicans．Inadditiontothestudyoffermentationprocess，wefocusedonthepurifica

6、tionoftheantifungalantibioticsinthiswork．Thiswouldbeusefulforthefurtherdevelopmentandapplicationsofthisnovelantibiotic．Thefermentationconditionswereoptimizedasfollowsunder250mLshakingflaskculture：initialpH6．5，inoculation8％(vol／v01)，rotatingspeed200r／min，liquidvolume40mL／250mL，28。C，fermentati

7、onperiod48h．Undertheaforementionedcondtions，antifungalactivityofthebrothreacheditspeakvalueas940．35U／mL．Furthermore，theprocesswasscaled—upin5Lcontinuousstirredtankreactor(CSTR)．Thepotencyofantifungalantibioticarrivedatitsmaximumvalueas950．5U／mLafte