泥鳅抗菌蛋白MAAP的分离、纯化、表征及生物活性研究

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1、华中科技大学博士学位论文泥鳅抗菌蛋白MAAP的分离、纯化、表征及生物活性研究姓名：董先智申请学位级别：博士专业：生物医学工程指导教师：徐辉碧;黄开勋2002.12.26华中科技大学博士学位论文渗}埘。o携摘要．泥鳅(Loach．MisgurnusanguillicaudatusCantor)系鳅科动物，肉或全体入药，收载于《中药大辞典》等典籍中。其主要功效为补脾益气、清热解毒、消痞散结、祛湿邪，治消渴、水肿黄疸、痢疾、阳痿等症。民间常用其粘液治疗痈肿、中耳炎；用活泥鳅捣碎外敷治疗乳癌、骨髓炎等，疗效显著。从这些疗法

2、的特征来看，有可能是通过泥鳅体内的某种生物活性分子而起作用，但目前关于泥鳅活体中这些活性物质的报道较少。本文报道了从泥鳅活体内分离、纯化出的一种新的具有抗菌活性的蛋白质分子MAAP(Misgurnusanguillicaudatusantimicrobialprotein)，同时对其理化特征及生物活性进行了研究。先成的工作主要包括以下几个方面：从泥鳅活体内纯化出泥鳅抗菌萤白MAAP。使用粗分离、SephadexG一50凝胶过滤层析、DE．52Cellulose阴离子交换层析等方法将泥鳅抗菌蛋白逐步纯化，最终用非变性

3、PAGE电泳得到具有较高纯度的MAAP样品，其产率为O．028％。用SDS．PAGE、尿素．SDS．PAGE监测蛋白质的纯化进程，发现粗分离、SephadexG一50；疑胶过滤层析、DE．52Cellulose阴离子交换层析等一系列步骤均不足以得到均一的蛋白样品；ND—PAGE是最终分离MAAP的关键步骤。用HPLC、IEF、TLC等多种方法对MAAP进行了一系列的纯度鉴定，其结果均指示MAAP为一个纯净的蛋白质。用多种方法对MAAP分子的理化特性进行了表征。用MALDI-TOF-MS法测定MAAP的分子量为11,

4、536Dalton；用IEF测得MAAP的等电点为4．78：氨基酸组成分析结果表明MAA约含111个氨基酸，主要由lO种氨基酸组成，其中半胱氨酸是含量最高的氨基酸，每个MAAP分子中约含有22个Cys：紫外光谱测定表明MAAP在192nnl处有多肽的特征吸收峰，在该波长处的消光系数为1．03×106Lmol-IClll～；MAAP经TPCK．胰蛋白酶降解后进行MALDI．TOF-MS分析，得到16／卜肽碎片峰；N端序列分析表明MAAP的前5个氨基酸的排列顺序为cyS．Phe．Gly．Trp．Asn。一系列鉴定实验的

5、结果提示MAAP不含有亚基、糖配基、脂配基和金属络合离子，是一个单链的简单蛋白质。对MAAP进行了相似性检索，经权成检索工具在世晃范围内检索，均未找到与MAAP匹配的蛋白质，提示MAAPI华中科技大学博士学位论文是一个新发现的蛋白质。用聚．L。赖氨酸构象模型法、Raman二阶导数谱法、FT-IR去卷积拟合法和概率模型法研究了MAAP的二级结构。研究结果表明：MAAP中a螺旋含量约为25％：p折叠约49％，p转角约16％；无序结构含量在10％左右。研究结果提示MAAP内部存在一个主要由a螺旋和D折叠形成的高度有序的疏

6、水核心，疏水核内的肽链通过Cys形成的二硫键相互交联从而形成了稳定的空间结构。采用比浊法和平板抑菌实验研究了MAAP的抗菌活性，实验结果表明MAAP对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用且量效关系明显：采用连苯三酚自氧化体系研究了MAAP的抗氧化活性，结果表明MAAP能有效清除连苯三酚自氧化过程中产生的超氧阴离子。这些结果表明MAAP是抗菌药物开发中一个有潜力的先导化合物分子。y＼／关键词：泥鳅蛋白质纯化表征生物活性抗菌肽、／、／，。一，。、。＼一，7II华中科技夫学博士学位论文===≮=≈=；#==

7、=；##；=；㈣#；=∞％_=；《∞#=自∞㈣AbstractLoachisakindoffishthatbelongstOthefamilyofMisgurnusanguitlicaudatusCantor．Itisrecordedin‘‘ADictionaryOfChineseTraditionalMedicine’’thatitsmeatorwholebodycallbeusedasChinesetraditionalmedicine．Themainpharmaceuticalfunctionsofloach

8、seeninfolkrecipesaretonourishspleenandenrichvitalenergy,torelieveinternalheatanddetoxi魏toeliminatecarbunclesandloosenscabs，toprotectliverandbringdownjaundice．Chinesepeoplehavebeenu