临床医学毕业论文牦牛中性粒细胞防御素的分离纯化及抗菌活性

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1、牦牛中性粒细胞防御素的分离纯化及抗菌活性姓名：2014年6月25日作者：董开忠，余四九，杨具田，王冬梅，蔡勇，雒晓芳【摘要】目的：分离牦牛中性粒细胞(PMN)防御素并检测其抗菌活性。方法：运用Percoll密度梯度离心法，从新鲜牦牛全血中分离纯化牦牛中性粒细胞，用50mL/L冰乙酸抽提，提取液经BioGelP10聚丙烯酰胺凝胶过滤和反相高效液相色谱(RPHPLC)分离纯化，对活性多肽进行质谱分析，并对其中3个肽进行氨基酸组成分析，用琼脂弥散法检测三种多肽的抗菌活性。结果：获得13种活性多肽，其中三个肽为牦牛屮性粒细胞防御素1〜3,并具有很强的抗菌活性。结论:PM

2、N存在防御素并具有广谱抗菌活性，在天然免疫中发挥着重要作用O【关键词】牦牛；分离纯化；中性粒细胞；防御素[Abstract]AIM:ToisolateandpurifypdefensinfromtheneutrophilsofYak.METHODS:ThemethodofpercollgradientcentrifugationwasemployedtopurifyneutrophilsfromYakperipheralblood.ThecrudeextractionfromYakneutrophilswasisolatedrespectivelythrough

3、awayofextractionionby50mL/Laceticacid,acidsolubleextractofYakneutrophilswasobtained.ThenitwasfurtherpurifiedbyBioGelP10PolyacrylamidegelfiltrationandRPHPLC,and9outof22apicesshowedantibacterialactivity.9apicesshowingantibacterialactivitywereselectedtobeanalyzedbymassspectrograph.Thean

4、tibacterialactivitiesoftheextractsfromeverystepwereanalyzedbyagaroseradialdiffusionassay.RESULTS:ThemolecularweightofthepurifiedYakBNBD13wasdeterminedtobe4.2,4.6and4.8kDabymassspectrograph.BNBD13fromYakneutrophilswereabletoeffectivelykillEscherichiacoli，StaphylococcusaureusandBacillu

5、ssubtilis.CONCLUSION:Yakneutrophilshavepdefensinwhichhavebroadspectrumantimicrobialactivity，Yakdefensinhasanimportantpartininnateimmunit.[Keywords]Yak;isolationandpurification;neutrophils;Pdefensin防御素(defensins)是生物细胞特定基因编码的A•有广谱抗微生物和细胞毒活性的多肽，是机体天然免疫系统的重要组成成分，广泛存在于各种动物［1，2］、植物［3］和昆虫体内

6、［4］，是一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗微生物多肽。根据防御素分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异可分为a防御素、p防御素、e防御素、昆虫防御素和植物防御素五种类型。p防御素是Diamond等［5］于1991年首次在牛的气管黏膜上皮细胞中发现，在哺乳动物的上皮细胞和嗜中性粒细胞内广泛表达。成熟的p防御素由38〜42个氨基酸残基组成，分子内含有6个保守的半胱氨酸，序列中部有一个保守的脯氨酸和一个甘氨酸，6个半胱氨酸形成三对由CyslCys5、Cys2Cys4、Cys3Cys6方式连接的二硫键［6］。研究表明防御素在体外对革兰阳性菌、革兰阴性菌

7、、分枝杆菌［7］、真菌［8］、部分被膜病毒［9］和肿瘤细胞等均異有很强的杀伤活性，同时具有免疫激活、连接先天性免疫与获得性免疫［10］，以及对炎症、创伤及神经损伤的修复等作用［11］。其作用研宂己引起科研工作荠的广泛关注。牦牛是我国高原地区的特有动物资源品种之一，具有耐氧、御寒、强抗病的生理特性。0前有关家畜、豚鼠、家兔和人的中性粒细胞防御素在国内外已奋报道，而对牦牛中性粒细胞(Polymorphonuclear,PMN)防御素的研究尚未见报道。木研宄旨在从PMN分离出具有抗菌活性的小分子多肽，并对其抗菌活性进行研究，以便对其结构与功能进行更深入的研宄。1材料和

8、方法1.1材料成年雄性牦