重组胸腺素α1 的克隆、表达与纯化论文

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1、重组胸腺素α1的克隆、表达与纯化论文.freelosinalpha1，Tα1）的串联体并进行纯化、鉴定.方法将Tα1的基因拆分为4个片段进行合成，退火后经PCR获得串联体基因，测序正确后克隆在硫氧还蛋白（thioredoxin）融合蛋白表达载体pThioHisA中，转化大肠杆菌TOP10菌株，IPTG诱导表达，表达的融合蛋白经过80℃热处理及阴离子交换柱Q-SepharoseFastFloosinα1;tandemrepeat;cloning;geneex-pression;fusionproteinsAbstract:AIMToexpresstand

2、emrepeatofthymosinalpha1（Tα1）ethodandtopurifyandiden-tifythefusionprotein.METHODSSplitTα1geneintofourfragments，synthesizethemrespectivelyandgetthetandemrepeatgeneofTα1byannealingandPCR.Aftersequencingtoidentifyitscorrectness，clonethegeneintofusionexpres-sionvectorpThioHisA，trans

3、formstheE.colistrainTOP10idandinducesentandQSepharoseFastFloatographyandi-dentifiedbyolecularethodofexpressingtandemrepeatgeneispractical.ThesuccessfulexpressionofTα1③hasestablishedafoundationforitsbiologicalactivityresearch.0引言1966年Goldstein等［1］首次报道了从小牛胸腺中提取的初步具有生物活性的激素样物质，命名为胸

4、腺素.随后的研究表明，它是由动物胸腺上皮细胞分泌的一类多肽和蛋白质激素的总称.胸腺素α1（thy-mosinalpha1，Tα1）是从胸腺素组分5（TF5）中分离纯化出的热稳定酸性多肽［2］，由28个氨基酸组成，pI值为4.2，相对分子质量为3108.它是一种具有多种生物学活性的免疫调节剂，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症［3］和免疫缺陷的研究中.虽然Tα1有着广泛的应用前景，但由于其编码的多肽过短，很难利用基因工程方法实现直接表达，所以目前商用的多是化学合成产品，价格较贵，使其临床应用受到限制.为了探索Tα1多聚体的可能的生物学活性及其基因的体外表达，我

5、们利用随机退火与PCR技术相结合的方法构建了Tα1的多串体基因，在大肠杆菌中成功地诱导了表达，纯化后获得了Tα1③融合蛋白，从而为进一步研究奠定了基础.1材料和方法1.1材料pGEM-3zf（-），pThioHisA质粒、DH5α，TOP10菌种由本中心保存，T4多核苷酸激酶、T4DNA连接酶、EcoRI、PstI为TaKaRa产品，TaqDNA聚合酶、DNA分子质量标准购自华美生物工程公司，低相对分子质量标准蛋白质（Mr14400～97400）购自上海丽珠东风生物技术有限公司，I抗Anti-ThioTMAntibody为Invitrogen产品，II

6、抗为Rabbitanti-MouseIgG-AP为华美公司产品.Tα1基因片段及PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成:sequence1（54bp）GACACCAGCAGCGAGATCACCACCAAGGACCGGAAGGAGAAGAAGGAGGTGGTG;sequence2（30bp）GAGGAGGCCGAGAACAGCGACGCCGCCGTG;sequence3（42bp）CTTGGTGGTGATCTCGCTGCTGGTGTCCACGGCGGCGTCGCT;sequence4（42bp）GTTCTCGGCCTCCTCCACCACCTCCTTCT

7、TCTCCTTCAGGTC;上游引物（38bp）GGAATTCATGTCTGATGCAGCCGTGGACACCAGCAGCG;下游引物（35bp）GCACTGCAGTCAGTTCTCGGCCTCCTCCACCACCT.1.2方法1.2.1串联体基因的获得将Tα1的氨基酸序列［4］按惯用码转化为核苷酸序列，并将其拆分成4个片段合成，合成产物的5’端磷酸化后进行退火，退火产物进行PCR扩增.首先95℃处理5min，加入Taq酶后进行30次循环反应，循环参数为:95℃1min，60℃45s，72℃1min，最后一次延伸反应10min.1.2.2PCR产物的克

8、隆、酶切和序列鉴定PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切取目的条带，用试剂盒进行纯化回收，经EcoRI