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时间:2019-05-12
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1、重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达作者:范伟全包晓群韩树海刘永刚张宏桂【摘要】 目的利用黄芪毛状根表达人胸腺素α1。方法合成人胸腺素α1基因,构建重组载体pCAMBIA1301hTα1,以黄芪下胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中,取潮霉素抗性毛状根用PCR法检测人胸腺素α1基因的整合,SDSPAGE、Western印迹法分析人胸腺素α1基因的表达。结果潮霉素抗性毛状根整合并表达了人胸腺素α1基因。结论重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中能够表达,为以黄芪毛状根为生物反应器工业
2、化生产人胸腺素α1提供了实验基础。【关键词】人胸腺素α1;黄芪毛状根;发根农杆菌;重组载体 人胸腺素α1(humanthymosinalpha1,hTα1)是一种强力的免疫增强剂,主要用于自身免疫性肝病、原发性免疫缺陷、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、黑素瘤、艾滋病及某些癌症(乳腺癌、肺癌、肝癌、胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肾癌等)、男性不育症、动脉粥样硬化等免疫缺陷病、免疫抑制性疾病及病毒病和肿瘤的治疗,具有良好的临床疗效〔1,2〕。本研究首先构建植物双元表达载体pCAMBIA13
3、01hTα81,然后通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中,最终在黄芪毛状根中表达人胸腺素α1,从而建立以毛状根作为生物反应器生产hTα1的方法。 1材料与方法 1.1材料 黄芪种子由中国草地研究所提供;发根农杆菌C58C1和质粒pCAMBIA1301载体由东北林业大学生命科学院惠赠;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成,限制性内切酶和连接酶购自大连宝生物公司,Western印迹法分析和其他试剂均购自北京鼎国生物技术公司。 1.2方法 1.2.1载体pCAMBIA1301hTα1的构建
4、 合成带碱性磷酸酶信号肽的hTα1基因片段,5′端引入NcoI位点,3′端引入BstbI位点。摇菌提质粒后用NcoI和BstbI酶切,回收目的片段后连接至pCAMBIA1301载体上。转化E.coli感受态,提取质粒用NcoI和BstbI酶切,切下150bp片段,鉴定载体构建的正确性。8 1.2.2制备工程菌 制备发根农杆菌C58C1感受态细胞,用载体pCAMBIA1301hTα1转化感受态细胞,涂板(Rif50mg/L,Km100mg/L,Sp100mg/L),37℃倒置培养12~16h,挑取单个菌
5、落,提取质粒,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后冻存菌种备用。 1.2.3转化黄芪毛状根 1.2.3.1培养黄芪无菌苗 清洗黄芪种子2次,在70%乙醇中浸泡1min,用无菌水冲洗3次,然后用0.1%升汞(HgCl2)进行表面消毒8min后,用无菌水浸洗5次,每次2min。接种在不含激素的MS(蔗糖3%,琼脂0.8%,pH5.8)培养基上进行无菌萌发,置于(25±1)℃植物气候培养箱中,4~7d后萌发长出无菌苗。 1.2.3.2培养工程菌 将发根农杆菌在YEB平板上划线培养。挑取单菌落接种于YEB液体培养基中
6、,28℃,200r/min条件下振荡培养,至OD600为0.6~0.8时按1%量接种于新鲜YEB培养基(pH85.8),添加乙酰丁香酮(AS)100μmol/L,继续培养至OD600为0.3~0.5时用于侵染。 1.2.3.3侵染转化毛状根 将无菌苗的胚轴纵向划出刀痕,注入工程菌液,1w左右即可长出毛状根,除菌,潮霉素抗性筛选(500mg/L头孢霉素,25mg/L潮霉素,0.3mg/LIBA的MS培养基),最终获得含hTα1基因的黄芪毛状根。 1.2.3.4转化毛状根培养体系的建立 将完全除菌后的毛状
7、根切段,转移至MS+0.3mg/LIBA培养基上(不含抗生素),置于(25±1)℃植物气候培养箱中,隔7d观察毛状根生长状况,共培养5w左右。 1.2.4PCR法检测hTα1基因在黄芪毛状根中的整合 提取黄芪毛状根基因组DNA,PCR扩增hTα1基因。上游引物:5′AATACCATGGCAGCCGGGAGCA3′,下游引物:5′GCCTTCGAACTCAGCTCTTAGCAG3′。PCR反应体系为50μl,含毛状根基因组DNA10ng。94℃预变性,5min后进入循环;94℃变性30s,58℃退火
8、40s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸108min,PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。 1.2.5SDSPAGE、Western印迹分析 取PCR阳性的毛状根各50mg,按文献方法〔3〕提取植物蛋白并进行SDSPAGE电泳,用北京鼎国生物技术公司生产的兔抗hTα1为一抗,山羊抗兔IgG(H+L)HRP作二抗进行Western印迹分析。 2结果 2.1酶切鉴定植物双元载体
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