重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达

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1、重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达作者：范伟全包晓群韩树海刘永刚张宏桂【摘要】　　目的利用黄芪毛状根表达人胸腺素α1。方法合成人胸腺素α1基因，构建重组载体pCAMBIA1301hTα1，以黄芪下胚轴为外植体，通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中，取潮霉素抗性毛状根用PCR法检测人胸腺素α1基因的整合，SDSPAGE、Western印迹法分析人胸腺素α1基因的表达。结果潮霉素抗性毛状根整合并表达了人胸腺素α1基因。结论重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中能够表达，为以黄芪毛状根为生物反应器工业

2、化生产人胸腺素α1提供了实验基础。【关键词】人胸腺素α1；黄芪毛状根；发根农杆菌；重组载体　　人胸腺素α1(humanthymosinalpha1，hTα1)是一种强力的免疫增强剂，主要用于自身免疫性肝病、原发性免疫缺陷、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、黑素瘤、艾滋病及某些癌症（乳腺癌、肺癌、肝癌、胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肾癌等）、男性不育症、动脉粥样硬化等免疫缺陷病、免疫抑制性疾病及病毒病和肿瘤的治疗，具有良好的临床疗效〔1，2〕。本研究首先构建植物双元表达载体pCAMBIA13

3、01hTα81，然后通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中，最终在黄芪毛状根中表达人胸腺素α1，从而建立以毛状根作为生物反应器生产hTα1的方法。　　1材料与方法　　1.1材料　　黄芪种子由中国草地研究所提供；发根农杆菌C58C1和质粒pCAMBIA1301载体由东北林业大学生命科学院惠赠；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，限制性内切酶和连接酶购自大连宝生物公司，Western印迹法分析和其他试剂均购自北京鼎国生物技术公司。　　1.2方法　　1.2.1载体pCAMBIA1301hTα1的构建

4、　　合成带碱性磷酸酶信号肽的hTα1基因片段，5′端引入NcoI位点，3′端引入BstbI位点。摇菌提质粒后用NcoI和BstbI酶切，回收目的片段后连接至pCAMBIA1301载体上。转化E.coli感受态，提取质粒用NcoI和BstbI酶切，切下150bp片段，鉴定载体构建的正确性。8　　1.2.2制备工程菌　　制备发根农杆菌C58C1感受态细胞，用载体pCAMBIA1301hTα1转化感受态细胞，涂板（Rif50mg/L，Km100mg/L，Sp100mg/L），37℃倒置培养12～16h，挑取单个菌

5、落，提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后冻存菌种备用。　　1.2.3转化黄芪毛状根　　1.2.3.1培养黄芪无菌苗　　清洗黄芪种子2次，在70%乙醇中浸泡1min，用无菌水冲洗3次，然后用0.1%升汞（HgCl2）进行表面消毒8min后，用无菌水浸洗5次，每次2min。接种在不含激素的MS（蔗糖3%，琼脂0.8%，pH5.8）培养基上进行无菌萌发，置于(25±1)℃植物气候培养箱中，4～7d后萌发长出无菌苗。　　1.2.3.2培养工程菌　　　将发根农杆菌在YEB平板上划线培养。挑取单菌落接种于YEB液体培养基中

6、，28℃，200r/min条件下振荡培养，至OD600为0.6～0.8时按1%量接种于新鲜YEB培养基（pH85.8），添加乙酰丁香酮（AS）100μmol/L,继续培养至OD600为0.3～0.5时用于侵染。　　1.2.3.3侵染转化毛状根　　将无菌苗的胚轴纵向划出刀痕，注入工程菌液，1w左右即可长出毛状根，除菌，潮霉素抗性筛选（500mg/L头孢霉素，25mg/L潮霉素，0.3mg/LIBA的MS培养基），最终获得含hTα1基因的黄芪毛状根。　　1.2.3.4转化毛状根培养体系的建立　　将完全除菌后的毛状

7、根切段，转移至MS+0.3mg/LIBA培养基上(不含抗生素)，置于(25±1)℃植物气候培养箱中，隔7d观察毛状根生长状况，共培养5w左右。　　1.2.4PCR法检测hTα1基因在黄芪毛状根中的整合　　提取黄芪毛状根基因组DNA，PCR扩增hTα1基因。上游引物：5′AATACCATGGCAGCCGGGAGCA3′，下游引物：5′GCCTTCGAACTCAGCTCTTAGCAG3′。PCR反应体系为50μl，含毛状根基因组DNA10ng。94℃预变性，5min后进入循环；94℃变性30s，58℃退火

8、40s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸108min，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。　　1.2.5SDSPAGE、Western印迹分析　　取PCR阳性的毛状根各50mg，按文献方法〔3〕提取植物蛋白并进行SDSPAGE电泳，用北京鼎国生物技术公司生产的兔抗hTα1为一抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP作二抗进行Western印迹分析。　　2结果　　2.1酶切鉴定植物双元载体