Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究.doc

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1、Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究刘展眉^,崔英德＜1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州510090:2.仲恺农业技术学院，广东广州510225摘要：喜^(Cumptothecaacuminate｝可产生具有抗癌作用的喜树碱,有许多用细胞培养方法制备喜树碱的尝试，但都因极低的产率而无从深入°植物毛状根培养的应用将成为一种生物碱生产的替代方法。以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)A41.2556感染喜树诱导产生毛状根，建立喜树碱毛状根产生体系。廿露碱检测及PCR结果证实发根农杆菌Ri质粒的rolB基因己在喜树毛状根基因组中整合

2、并得到表达。确定了用RP-HPLC测定发根培养基中喜树碱的的方法，比较了不同的吸附树脂对培养基中喜树碱的富集能力，从培养30d的喜树培养基屮获得喜树碱干质量分数为0.14mg-g关键词：喜树(Camptotheca发根农杆菌：喜树碱中图分类号：Q946文献标识码：A文章编号：1672-2175(2007)04-1266-05Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定，分化程度高、不易变异等特点，而且可把二次代谢物分泌至培养基屮。从毛状根屮分离检测出的次生代谢物质包括生物碱、蔥酿、蔡醞、单诂、二帖、黄酮类、多糖类、皂廿、蛋

3、H等各种成分，在这方面的研究取得了可喜的成就。MORGANT山建立的29个LI本葭君毛状根无性系均能生产阿托品烷生物碱，其质量的增加比正常植株的高出102倍，萇君碱质量分数达1.3%,为原植株根屮含最的3倍。Yoshikawa⑴通过人参愈伤纽.织诱导出毛状根，在无外源激素的条件下，其生长速度是愈伤纽•织的2倍,人参皂甘含量最高为干质量的0.95%高于再生根(0.91)和天然栽培根(0.4%)的含量，建立了发根农杆菌诱导人参产生人参皂背的高效培养体。HamillJD等人⑶用发根培养体系产生烟碱，烟碱含量与同品种体内根产生的烟碱水平相当。喜树(Camptothec

4、aacuminate)为洪桐科(Nyssaceae)喜树属(CamptothecaDecne)植物；为中国特有树种。喜树全株都含喜树碱(Camptothecme),对朕腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、了宫颈肿瘤及艾滋病等到均有效，加Z可以口服，且对心、肺、肝、肾和神经毒性较小，已成为世界抗肿瘤药物市场上主要品种。Yamazaki[4]用发根农杆菌(Rhizobiaeae)利丿IJ矮蛇根草(Op/zSM/zGpurnila)发根培养生产喜树碱。矮蛇根草发根培养不仅能产生喜树碱，而且对把二次代谢物如喜树碱分泌至培养基中。目前，未见关于从喜树发根培养基屮

5、提取喜树碱及其次生代谢产物的报导。为此，本文利用含Ri质粒的发根农杆菌对喜树进行诱导及转化，获得能在无激素的培养基上自主生长的毛状根，研究了毛状根生长条件及培养基屮喜树碱的含量。为喜树发根的大量培养和提高喜树碱的含量更定技术基础。1实验部分1.1主要仪器与材料ThermoLQCDECAxP液相色谱一质谱连用仪，Finnign公司(美国)，带电喷雾离了源；大气压化学电离源，质量范围50〜2000pm。Biorad凝胶成彖系统,HybaidPCR仪0Agilent1100系列高效液相色谱仪；高压灭菌锅、水平电泳槽及高压电泳仪。台式离心机。Eppendorf离心管等

6、，分光光度计。喜树碱标准品，购自黄石市园健医药科技有限公nJ,纯度为98%；发根农杆菌(Mgebc/cZ加肋rhizogenes)菌株A41.2556为广东微生物研究所保存菌种；抗生素：头抱II塞腭钠，哈药集团制药总厂；裂解液，购自华美工程公司；PCR引物购自上海生工技术公司。1.2实验方法1.2.1细菌菌株及培养将发根农杆菌A41.2556,安甑瓶开封，加入0.5mL的无菌水，使冷冻菌体溶解呈悬浮状，取0.2mL菌体悬浮液，移植于YEB琼脂培养基上，28°C培养，活化2〜3次，再挑取单菌落转接到YEB液体培养基中,至摇床上160rmin'1,28°C，暗处培

7、养2d,测定OD&g值为0.8时供感染用。1.2.2外植体制备于九月份从树上采集果实，剥取种了。冲洗，再用体积分数为70%的乙醇泡洗30s,最后用》v=l%次氯酸钠溶液对种了•进行10min的表面灭菌。灭菌后川无菌水漂洗3次，在无菌操作台屮将种売和种皮剥去，取幼胚作为培养的出发材料.培养基为琼脂固化MS,添加w=2%蔗糖(不添加任何激素)。将幼胚平放轻压到培养基表面。在黑暗条件下培冇10d左右，待胚根萌发，小苗基本直立后转移到光照条件下培育。1〜2个月后，胚胎生长成为带有7〜8张叶片的小苗。可以将小苗切成2〜4段，每段含有1〜2个侧芽，浅插培冇到增殖培养基上。

8、培养基成分为:琼脂固化MS,添加2%蔗