ri 质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究

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1、刘展眉等：Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究1269Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究刘展眉1,2,崔英德21.广东工业大学轻工化工学院,广东广州510090;2.仲恺农业技术学院,广东广州510225摘要：喜树(Camptothecaacuminate)可产生具有抗癌作用的喜树碱，有许多用细胞培养方法制备喜树碱的尝试，但都因极低的产率而无从深入。植物毛状根培养的应用将成为一种生物碱生产的替代方法。以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)A41.2556感染喜树诱导产生毛状根，建立喜树碱毛状根产生体系。甘露碱检测及PCR结果证实发根农杆菌Ri质粒的r

2、olB基因已在喜树毛状根基因组中整合并得到表达。确定了用RP-HPLC测定发根培养基中喜树碱的的方法，比较了不同的吸附树脂对培养基中喜树碱的富集能力，从培养30d的喜树培养基中获得喜树碱干质量分数为0.14mg·g-1。关键词:喜树(Camptothecaacuminate)；发根农杆菌；喜树碱中图分类号：Q946文献标识码：A文章编号：1672-2175（2007）04-1266-05刘展眉等：Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究1269Ri质粒诱导的发根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单、次生代谢产物含量高且稳定，分化程度高、不易变异等特点，而且可把二次代谢物分泌至培养基中。

3、从毛状根中分离检测出的次生代谢物质包括生物碱、蒽醌、萘醌、单萜、二萜、黄酮类、多糖类、皂苷、蛋白等各种成分，在这方面的研究取得了可喜的成就。MORGANT[1]建立的29个日本莨菪毛状根无性系均能生产阿托品烷生物碱，其质量的增加比正常植株的高出102倍，莨菪碱质量分数达1.3%，为原植株根中含量的3倍。Yoshikawa[2]通过人参愈伤组织诱导出毛状根，在无外源激素的条件下，其生长速度是愈伤组织的2倍，人参皂苷含量最高为干质量的0.95%高于再生根(0.91)和天然栽培根(0.4%)的含量，建立了发根农杆菌诱导人参产生人参皂苷的高效培养体。HamillJD等人[3]用发根培养体系产生烟

4、碱，烟碱含量与同品种体内根产生的烟碱水平相当。喜树（Camptothecaacuminate）为珙桐科（Nyssaceae）喜树属（CamptothecaDecne）植物；为中国特有树种。喜树全株都含喜树碱(Camptothecme)，对胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、子宫颈肿瘤及艾滋病等到均有效，加之可以口服，且对心、肺、肝、肾和神经毒性较小，已成为世界抗肿瘤药物市场上主要品种。Yamazaki[4]用发根农杆菌（Rhizobiaeae）利用矮蛇根草（Ophiorrhizapumila）发根培养生产喜树碱。矮蛇根草发根培养不仅能产生喜树碱，而且可把二次代谢物如喜树碱分泌至

5、培养基中。目前，未见关于从喜树发根培养基中提取喜树碱及其次生代谢产物的报导。为此，本文利用含Ri质粒的发根农杆菌对喜树进行诱导及转化，获得能在无激素的培养基上自主生长的毛状根，研究了毛状根生长条件及培养基中喜树碱的含量。为喜树发根的大量培养和提高喜树碱的含量奠定技术基础。1实验部分1.1主要仪器与材料ThermoLQC·DECA×P液相色谱－质谱连用仪，Finnign公司（美国），带电喷雾离子源；大气压化学电离源，质量范围50~2000µm。Biorad凝胶成象系统，HybaidPCR仪。Agilent1100系列高效液相色谱仪;高压灭菌锅、水平电泳槽及高压电泳仪。台式离心机。Eppen

6、dorf离心管等，分光光度计。喜树碱标准品，购自黄石市园健医药科技有限公司，纯度为98％；发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)菌株A41.2556为广东微生物研究所保存菌种；抗生素：头孢噻腭钠，哈药集团制药总厂；裂解液,购自华美工程公司；PCR引物购自上海生工技术公司。1.2实验方法1.2.1细菌菌株及培养将发根农杆菌A41.2556，安瓿瓶开封，加入0.5mL的无菌水，使冷冻菌体溶解呈悬浮状，取0.2mL菌体悬浮液，移植于YEB琼脂培养基上，28℃培养，活化2～3次，再挑取单菌落转接到YEB液体培养基中，至摇床上160r·min-1，28℃，暗处培养2d，测定O

7、D6oo值为0.8时供感染用。1.2.2外植体制备于九月份从树上采集果实，剥取种子。冲洗，再用体积分数为70％的乙醇泡洗30s，最后用w=刘展眉等：Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究12691%次氯酸钠溶液对种子进行10min的表面灭菌。灭菌后用无菌水漂洗3次，在无菌操作台中将种壳和种皮剥去，取幼胚作为培养的出发材料.培养基为琼脂固化MS，添加w=2％蔗糖（不添加任何激素）。将幼胚平放轻压到培养基表面。在黑暗条件下培育10d