重组胸腺素α1 的分离纯化和活性测定

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1、重组胸腺素α1的分离纯化和活性测定　　摘要:目的利用融合表达载体pThioHisA的重组质粒pThioHisA-Tα1④，转化大肠杆菌TOP10得到的工程菌，来分离纯化表达的胸腺素α1（thymosinalpha1，Tα1）.方法将高效表达融合蛋白的工程菌用细胞破碎器裂解，经80℃热处理，离心上清采用Q-SepharoseFF阴离子交换色谱纯化融合蛋白.融合蛋白经Br裂解后用常压离子交换色谱纯化Tα1单体.应用SDS-PAGE，2L-Tricine-SDS-PAGE和HPLC进行鉴定.结果SDS-PAGE分析表明菌体表达的融合蛋白占菌体总

2、蛋白的400gkg-1.经2L-Tricine-SDS-PAGE分析证实，融合蛋白可裂解出Tα1单体，裂解物经简单的离子色谱可以纯化出Tα1单体，HPLC鉴定纯化出的Tα1纯度可达950gkg-1以上.利用3H-TdR进行的生物活性测定表明，在致有丝分裂原ConA存在的条件下，融合蛋白和Tα1单体均具有刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力，与化学合成的Tα1相比具有相似的生物活性.结论该方法是分离纯化Tα1简便易行，经济有效的方法;同时也为Tα1的分离纯化和大规模的开发生产奠定了基础.　　Keyosinalpha1;fusionexpress

3、ion;proteinpu-rification;biologicalactivity　　Abstract:AIMTopurifyandpreparethymosinalpha1（Tα1）.METHODSTheengineeringbacteriaTOP10includ-ingrebinantplasmidofafusionexpressionvectorpThio-HisATα1geneof4repeats（Tα1④）peratureof80℃for10min-utes，andcooledquickly.ByQ-SepharoseFas

4、tFloatography，thefusionproteinthesuper-natantofthelysate.Attheconcentrionof0.5molL-1Brcleavageofthefusionproteinin700mLL-1formicacid，Tα1ethodsofSP-SepharoseFastFloethodsandprovedby2L-Tricine-SDS-PAGEanalysis.HPLCshoilarbiologicalactivitytothatofthesynthesizedTα1.Theycould

5、increasetheproliferativere-sponseofthemitogenConAstimulatedspleenlymphocytes.CONCLUSIONMethodisconvenientandsimpleforpurifi-cationandpreparationofTα1inlargescale.　　0引言　　胸腺素α1（thymosinalpha1，Tα1）是从胸腺素组分5（TF5）中分离纯化出的由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，其Mr为3108，pI4.2［1，2］.在各种抗原或致有丝分裂原激活后，Tα1能够

6、增加T细胞IFN［3］，IL-2［4］和IL-3［5］等淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平;Tα1还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性［6，7］;在活体内Tα1能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌IL-2并增加IL-2受体的表达作用［4，7］;配伍其他细胞因子具有抗肿瘤作用［8］.Tα1临床用途广泛，已应用于治疗乙肝［9］、丙肝［10］、癌症［8，11］及免疫缺陷［12］等疾病的研究中，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂.　　目前国外化学合成的Tα1已临床应用，但价格昂贵.我们利用硫氧还蛋白

7、-Tα1④融合基因在E.coli中的表达，经简单的预处理和离子交换色谱，得到了纯度较高的融合蛋白，把融合蛋白进行裂解获得了高纯度的Tα1单体，且具有较高的生物活性.该研究旨在寻找简便易行、经济有效地纯化和生产Tα1的技术方案，为今后的大批量生产奠定切实可行的工艺流程基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌体的获得重组质粒pThioHisA-Tα1④由本中心构建，由重组质粒pThioHisA-Tα1④转化E.coliTOP10［基因型为FˉmcrAΔ（mrr-hsdRMS-mcrBC）Φ80lacZΔM15ΔlacX74deoR

8、recAlaraD139Δ（ara-leu）7697galUgalKrpsLendAlnupG］.挑单克隆接种于5mLLB培养液，37℃振荡培养至A600nm为0.6，按50mLL-1接种于新