甘露聚糖结合凝集素的分离纯化和活性研究

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1、浙江大学硕士学位论文甘露聚糖结合凝集素的分离纯化和活性研究姓名：沈杰申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：尚世强2003.5.1浙江大学硕士学位论文甘露聚糖结合凝集素的坌盎幽活性研究浙江大学研究生院学院：医学院专业：儿科学研究生：沈杰导师：尚世强摘要fl研究背景与日的：甘露聚糖结合凝集素(mannan-biadinglect／n。硒L，，又称甘、露糖结合凝集素(mannose-bindinglectin,MBL)，是一种钙离子依赖的(c型)血清凝集素，在防御抵抗多种病原微生物的天然免疫中起着重要的作用，对6个月到2岁的婴幼儿尤其重要。MBL是一个由若干个相

2、同的亚单位组成的寡聚体分子．每条肽链的C端是一凝集素结构域(碳水化合物识别结构域)。近N端是一胶原样区。这两个结构区与MBL的生物学功能密切相关。其凝集素结构域可以与某些符定的糖配体结合，尤其是与病原微生物表面的糖链结合后，可通过胶原样区激活MBL相关丝氨酸蛋白酶，进而激活补体系统，这条途径称为凝集索途径。MBL也可直接与吞噬细胞表面的胶原凝素受体结合，发挥调理吞噬功能或引起其它的免疫反应。正常情况下MBL的血清浓度很低，1．Smg／L左右，但在感染的早期可升高2-3倍。因基因突变而导致的MBL表达水平降低或结构异常，与免疫功睦处于不成熟阶段的儿童对感染的易

3、感性增强密切相关。l，浙江大学硕士学位论文本研究旨在用亲和层折法分离纯化出MBL分子，并测定其与单糖配体以及与儿童临床上常见细菌的结合括性，探讨其在儿童天然免疫中的作用。方法：将甘露聚糖与溴化氰活化的Scpharose4B偶联，制成亲和柱基质——甘露聚糖-$epharosc4B。将羊血清或人血浆过亲和拄，在钙离子存在的条件下，MBL分子可与柱上的甘露聚糖结合。用EDTA通过螯合钙离子，从亲和柱上洗脱MBL，从而分离纯化出MBL。用还原性10％SDS-PAGE测定羊及人MBL分子单体的分子量。羊血清MBL经胶原酶消化后，将其产物行还原性10％SDS—PAGE，

4、观察MBL分子量的变化。用酶联凝集素试验测定羊血清MBL与单糖配体及与常见细菌的结合活性。fI结果：①MBL的分离纯化：羊血清与人血浆分别经亲和层析后，得到纯化的t、MBL分子。在还原条件下行SDS-PAGE，羊血清MBL在29kD和33kD及更高分子量处有蛋白质条带；人血浆MBL在30kD及90kD处有蛋白质条带；②MBL分子胶原样结构的鉴定：羊血清MBL分子被胶原酶消化后。在还原性SDS-PAGE上显示22．4kD及21．6kD处有蛋白质条带；③羊血清M日L与单糖配体的结合活性：羊血清MBL分子对各单糖配体的结合有一定的选择性，从大到小依次为：N-乙酰氨

5、基葡萄糖>L．岩藻糖>D．氨基葡萄糖>N一乙酰氨基半乳糖；④羊血清MBL与常见细菌的结合活性：羊血清MBL对不同的细菌有不同的结合力：对解鸟氮酸克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌有很强的结合力；对溶血性葡萄球菌、阴沟肠抒菌、表皮葡萄球菌的结合力相对较弱；对肺炎克雷伯氏菌、．流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌的不、／。同菌株结合力差异较大。y结论：用甘露聚糖-Sepharose4B亲和柱行亲和层析能从哺乳动物血清(血．2．浙江大学硕士学位论文浆)中分离纯化出有活性的MBL分子，人血浆MBL单体的分子量是301d)，羊血清MBL单体有两种，分子量分另0为29kD和33kD。羊血

6、清MBL分子与其它哺乳动物的MBL分子一样，也具有胶原样结构域。羊血清MBL对各种单糖的结合有不周的选择性，其选择性与人血浆／VIBL类似。羊血清／vlBL对不同的细菌有不同的结合力，对革兰氏阴性菌的结合力相对较阳性菌强。／7，-r／【关键词]甘露聚糖结合凌；≥螽：儿童；天然j昔彩糖识别：细菌．3，新扛大学硕士学位论文PurificationandCharacterizationofMannan-bindingLectinGraduateStudent：JIESHENSupervisor：SHI—QIANGSHANGAbstractBackgroundand

7、OMeetive：Marman-bindinglectin(syn：TnaD．,n_ose-bindinglectin，bibL)isaCaZ+．．dependent(c-typO毹彻leetin．Ithas勰importantroleintheinnateill-lmullesystemagainstpathogenicmicroorganisms,especiallyforchildrenof6monthsto2yearsold．MBLisnlloligomercomprisedofseveralidenticalsubunits．Eachp印ddech

8、ainhasaC．terminallectindom