β-甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究

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1、万方数据学校代码：10225学号：S14543学位论文B一甘露聚糖酶发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：刘祖艳刘租艳赵敏教授东北林业大学硕士2014年4月东北林业大学学科专业：论文答辩日期：授予学位日期：微生物学2014年6月答辩委员会主席：王立群论文评阅人：许修宏／葛菁萍◆东岁参栉素大学万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S14543DissertationforthedegreeofMasterFermentationconditionopt

2、imizationofbeta--mannanase，itspurificationandenzymologycharacteristicsCandidate：Supervisor：AcademiedegreeAppliedfor：Speciality：DateofOralExamination：University：LiuZuyanProf．ZhaominMasterMicrobiologyJune．2014NortheastForestry万方数据摘要随着新型资源半纤维素日益受重视和甘露寡糖医用营养价值的发现，加上p．甘露聚糖酶在各

3、个领域的潜在应用价值，有关p．甘露聚糖酶的相应研究逐步开展，并取得了一定的成果。本文首先优化了东北林业大学微生物实验室保存的工程菌株毕赤酵母(PichiaPastor&)Manl2．17的发酵D．甘露聚糖酶条件，然后对最佳产酶条件下的发酵液进行纯化并研究了其酶学特性。获得如下成果：(1)通过单因素实验和正交试验相结合，获得最佳产酶条件：发酵温度29℃，底物浓度0．01％，初始发酵液pH6．00，发酵时间4d，甲醇浓度0．5％，接种量OD600值为1．0。优化前酶活力为3797．29U／mL，优化后酶活力为5009．4U／mL，提高了31

4、．93％。(2)在最佳产酶条件下获得的发酵液为初始材料，通过硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE．SepharoseFastFlow阴离子交换层析、G75葡聚糖凝胶等一系列步骤，获得了只有单一目的条带的电泳纯酶蛋白组分。纯化后的酶比活力为8341．14U／mg，回收率为61．68％，纯化倍数高达743．42。在同类研究中，处于领先水平。(3)研究确定了该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH为6．30，选择磷酸二氢钠．磷酸氢二钠缓冲液。在pH6．30．pH7．10的弱酸条件下和65"C以下，酶稳定性良好。不同金属离子、EDTA、SDS、有机试

5、剂和不同浓度的NaCl均对酶活性产生不同程度的影响。根据Lineweaver-Burk双倒数作图法和公式1Ⅳ=lⅣmax+(KmⅣm。。)·(1／[S】)，得出该酶对魔芋粉的动力学参数，Km为0．009mmol／L，Vm默为10000U／mg。与催化刺槐豆胶相比，p．甘露聚糖酶明显对魔芋胶有更好的催化特异性。关键词毕赤酵母(PichiaPastoris)；B一甘露聚糖酶；优化；纯化万方数据AbstractAsthedevelopmentofnewresourceshemicelluloseandthediscoveryonmedical

6、nutritionofmannanoligosaccharide，furthermorepotentialapplicationvalueinmanyareasofbeta-mannaIlase．correspondingresearchonbeta．mannanasecarriedoutstepbystepandachievedsomeresults．Inthisstudy,fermentationconditionsofPichiaPastorisengineeringstramManl2．．17savedinourlaborato

7、rywasoptimizedfirstly．Thenpurificationofinducedfermentedliquidunderthebestconditionstoproduceenzymewascarriedout．Atlast，itsenzymologycharacteristicswerestudied．Itprovidesreferencesforbeta。mannanaseresearchesandlaysafoundationontheindustrialproductionoflowcostenzymes·(1)T

8、hroughthesinglefactorexperimentandorthogonalexperiment，wehadgotthebestconditionsofenzymeproduction．Ferm