甘露聚糖结合凝集素对人中性粒细胞功能的影响

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文甘露聚糖结合凝集素对人中性粒细胞功能的影响PreliminaryStudyontheRolesofMannan-·bindingLectininRegulatingPolymorphonuclearneutrophils(PMN)Function’课题来源：国家自然科学基金(30972679)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委员会主席答辩委员会成员陈阿德陈政良教授免疫学学术型硕士研究生基础医学院金伯泉教授第四军医大学龚非力教授华中科技大学吴长有教授中山大

2、学郑利民教授中山大学涂文伟教授香港大学向军俭教授暨南大学富宁教授南方医科大学2013年4月26日广州讯嘈稀IJ胁拽蛳指正渤：倦刊终&寸r≥、j-叼硕士学位论文甘露聚糖结合凝集素对人中性粒细胞功能的影响硕士研究生：陈阿德指导教师：陈政良教授摘要天然免疫系统是抵御病原微生物感染的第一道防线，其主要由参与天然免疫的效应分子和效应细胞构成。常见的效应分子有防御素、补体系统、细胞因子和溶菌酶等；效应细胞有吞噬细胞和NK细胞等。天然免疫的识别机制是由多种识别分子及效应分子组成的复杂的网络结构，其可通过模式识别受体(pat

3、temrecognitionreceptor，PRR)如甘露聚糖结合凝集素(mannan．bindinglectin，MBL)、肽聚糖识别蛋白、Toll样受体(Toll．1ikereceptor，TLR)等识别病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattem，PAMP)识别相关的病原微生物而发挥作用，参与机体的免疫调节。MBL为肝脏合成的血浆蛋白，是天然免疫补体系统中启动凝集素途径的关键蛋白。MBL是一种分泌型PRR，是C型凝集素超家族中胶凝素(collectins)家族的

4、一员。MBL可选择性识别多种病原体表面的糖结构，可通过凝集素途径以不依赖抗体和Clq的方式激活补体，从而介导调理吞噬作用及发挥溶破和间接调理功能，并能与吞噬细胞表面胶凝素受体结合而直接介导调理吞噬作用，还能清除免疫复合物和凋亡细胞。正常人血浆中的MBL水平在40。5000肛g／L之间，但是作为一种急性期反应蛋白，在应激(如病原体感染、外科手术等)时，其血浆浓度可升高2～3倍。现己发现，胶凝素家族的其他成员如肺表面活性物质相关蛋白A和D(surfactantProteinA、surfactantproteinD

5、，SP．A、SP．D)、中文摘要补体Clq等具有多种免疫调节功能，如SP．A能够抑制DC的成熟和分化；Fraser等发现MBL能够抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的单核巨噬细胞分泌TNF．Q等细胞因子。而目前国内外关于MBL对中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils，PMN)功能的影响报道较少，因此有必要深入探讨。本研究中，我们利用人PMN为细胞模型，初步研究了有无MBL缺陷人血清条件下MBL对PMN功能的影响，及在白色念珠菌刺激下对PMN功能的影响。

6、第一章人天然MBL的提取与纯化MBL是肝细胞分泌的血浆蛋白，是天然免疫系统中一个关键的可溶性模式识别受体。正常人血浆中MBL含量较低，约10-～500099／L，平均约为120099／L。基于本科室的长期工作基础，已经建立了对人天然MBL分离纯化的方法。因有文献报道热原及血浆中IgG有可能干扰实验，因此在本研究中，我们通过甘露聚糖．Sepharose4B亲和层析体系，分离得到粗提MBL，经LC柱和多粘菌素B凝胶柱去除IgG与LPS，最后得到无热源的人天然MBL蛋白。通过SDS．PAGE和Westemblot检

7、测纯化MBL的纯度及存在形式；同时应用配体结合实验鉴定MBL的活性。同时SDS．PAGE和Westemblot结果显示纯化得到的MBL主要以高聚体的形式(分子量>200KD)存在，杂蛋白IgG得到明显的去除；同时鲎试剂检测表明，经过多粘菌素B凝胶柱纯化后的MBL中残余的LPS量符合无热源要求；并通过配体结合实验证实所得的MBL仍保持良好的结合活性，为后续的实验开展提供可靠的保证。第二章存在补体时MBL对人PMN功能的影响PMN作为天然免疫中重要的吞噬细胞，在抗病原微生物感染中起着重要作II硕士学位论文用。其在

8、炎症局部促炎因子和趋化因子的作用下，可快速迁移到炎症部位并通过释放炎性细胞因子、活性氧及脱颗粒等发挥抗感染作用。PMN作为人体数量最多的吞噬细胞，在天然免疫防御中发挥着极其重要的意义；但在免疫调节紊乱的情况下，PMN可能加重炎症反应从而使机体产生严重的损害，因此对PMN功能调节的研究显得尤为重要。由于MBL也是天然免疫系统重要的效应分子，因此我们研究MBL对PMN功能的影响。我们采用ELISA和Do