重组绵羊甘露聚糖结合凝集素(mbl)的制备及其对绵羊抗病效果的分析

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1、I万方数据分类号：密级：学号：2011103018单位代码：10759石河子大学硕士学位论文重组绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)的制备及其对绵羊抗病效果的分析学位申请人王小义指导教师赵宗胜教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称遗传学研究方向动物遗传育种所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2014年6月II万方数据PreparationofRecombinantMBLandResponseAnalysisofResistancetoSheepDiseaseADissertationSubmit

2、tedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNaturalscienceByWangXiaoyi(AnimalGenetics)DissertationSupervisor:Prof.Zong-shengZhaoSubmittedtime:June2014ShiheziXinjiangChinaIII万方数据石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学

3、位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要

4、汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日IV万方数据摘要甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin,MBL)又称作甘露糖结合凝集素(mannose-bindinglectin,MBL)，在有机体天然免疫系统起着至关重要的作用，通过不依赖抗体的补体激活作用，该蛋白将有机体的补体系统启动，继而发挥免疫调理的作用，因此，它在抵抗病原体感染中具有重要作用。研究发现MBL生物学功能的实现有赖于其完整的蛋白质结构，MBL结构基因突变影响了蛋白

5、多聚体的功能性和稳定性，使得MBL血清浓度明显降低，机体的免疫防御和监视能力削弱，导致机体对多种病原的易感。此外，由于绵羊支原体肺炎难于控制和消灭，并且在新疆较为严重。因此本研究以MBL和绵羊肺炎支原体（MycoplasmaOvipneumoniae，MO）为研究对象进行了如下实验，以探究MBL与绵羊支原体肺炎及其他传染性疾病的相关性，为今后研发治疗绵羊支原体肺炎的药物提供了理论依据，研究结果如下：(1)ELISA检测中国美利奴羊感染绵羊肺炎支原体的免疫应答变化：选择3只羔羊作为对照组，13只为实

6、验组，在相同饲养条件下人工感染绵羊肺炎支原体，采集攻毒前1d、攻毒后1d、7d、14d、21d的血清，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同个体免疫因子，如TNF-α、IFN-γ、补体C1、C3的水平。结果显示感染MO后，IFN-γ水平第1d降低，第7d达到最高，即15.13（pg/ml），之后又开始降低，但与攻毒前水平相比仍然较高；TNF-α的水平有所升高，升高幅度较正常对照组不明显，在第14d出现最高水平32.78（pg/ml），但之后降低；C1水平差异不显著；C3水平第1d降低，之后升高

7、，第21天出现最高值12.66（mg/ml）。结论：通过IFN-γ、TNF-α、补体C1、补体C3水平的变化情况，可以推测绵羊患支原体肺炎的程度。(2)人工感染绵羊肺炎支原体后MBL变化及组织病理学分析：感染MO后，ELISA检测MBL水平，并对不同MBL水平的羔羊进行组织病理学评分，以对其肺炎程度进行量化评价，结果显示攻毒前血清MBL水平越高，组织病理学评分越低，所以可得：MBL对绵羊肺炎支原体有一定的抗性。(3)天然、重组绵羊MBL的制备：利用PEG-6000从绵羊血清中提取天然MBL。分别将

8、真核表达载体pPIC9K和克隆载体pMD18-T-MBL经NotI、SnaBI双酶切，然后连接获得重组表达载体pPIC9K-MBL，将其转化毕赤酵母GS115，将获得的天然、重组MBL行SDS-PAGE检测。结果为：天然、重组MBL中均有预测的条带出现。结论：天然MBL中也有非预测的条带，因此获得的天然MBL不纯；重组MBL表达量少，不足以进行后续纯化。(4)细胞、个体水平研究攻毒后，MBL对免疫因子TNF-α和IL-2的影响：感染前实验组分别注射人MBL和羊MBL，结果为：细胞水