绵羊早孕因子蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

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1、万方数据分类号：S墨2§密级：公珏单位代码：学号：．卫QQ逝2011386绵羊早孕因子蛋白的表达及其多克隆抗体的制备1一●^’'^lIExpressionolsheepearlyPregnancyIactoralldoreparationofpolyclonalantibodyagainstearlypregnancvfactor一一●■，学位申请人：宋立峰指导教师：刘月琴教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一四年五月二十五日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除

2、了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇堡垒些蠢堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字目期：∞I中年亨月《日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦壑些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在

3、解密后适用本授权书)学位论文作者签名：籀甄导师签名：签字日期：10悼年s月“El签字日期：学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：，b≯易]f刃阵柳佻万方数据基金项目资助国家现代农业产业技术体系，编号：CARS一40—21；农业科技成果转化资金，编号：212GB2A200031万方数据摘要早孕因子(Earlypregnancyfactor，EPF)是目前在哺乳动物妊娠早期血清中发现的最早的与妊娠相关的免疫抑制因子和生长调节因子，其可检测时间远远早于人绒毛膜促性腺激素(HCG)，并且早孕因子对妊娠母体具有很高的特异性，对早孕因子检测方法的开发与应用对于畜牧生产具有

4、重要意义。目的：应用原核表达技术制备早孕因子蛋白，将其与弗氏佐剂混合后对家兔进行免疫，制备抗早孕因子多克隆抗体，为进一步研究开发早孕因子检测试剂盒奠定基础。方法：以妊娠绵羊卵巢组织为样本提取总RNA，反转录得到单链eDNA，通过PCR扩增分别得到带有EcoRI与XhoI酶切位点和NcoI与XhoI酶切位点的两条绵羊早孕因子编码基因。然后进行TA克隆，双酶切反应，经T4连接酶分别与表达载体pGEX．4T-1与pET20b重组，并转化表达菌株BL21(DE3)感受态。在异丙基．B．D．硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导下，表达产生融合GST标签与His标签的早孕因子蛋白。通过GST亲

5、和吸附层析柱与Ni亲和吸附层析系统得到融合蛋白纯品，经SDS—PAGE和WestemBlot鉴定分析重组蛋白的表达。使用纯化得到的融合GST标签的早孕因子蛋白与弗氏佐剂按等比例混匀后，免疫家兔制备早孕因子多克隆抗体。以融合His标签的早孕因子蛋白为包被原，通过间接ELISA法测定抗体效价，并通过WesternBlot试验检测血清抗体对早孕因子蛋白的识别、结合能力。通过临床试验检测20只绵羊妊娠情况，进行血清抗体实际应用验证。结果：大肠杆菌原核表达得到的早孕因子融合GST标签的早孕因子蛋白分子量约为36kDa，融合His标签的早孕因子蛋白分子量约为12kDa，与理论值相符。两种重

6、组早孕因子融合蛋白在大肠杆菌中确实得到了高效表达和理想的纯化效果，免疫家兔57d后血清抗体滴度达到了l：12000，血清抗体能够识别早孕因子蛋白，并且血清抗体实际检测应用检测正确率达95％。早孕因子重组子在大肠杆菌中得到了丰富表达，制备的早孕因子多克隆抗体具有良好的生物活性与特异性。关键词：早孕因子；原核表达；多克隆抗体；ELISA万方数据ExpressionofsheepearlypregnancyfactorandpreparationofpolyclonalantibodyagainstearlypregnancyfactorAuthor：SongLifengSuperv

7、isor：ProfessorLiuYueqinMajor：AnimalGenetics，BreedingandReproductionAbstractEarlypregnancyfactor(EPF)isapregnancy—associatedproteinthathasimmune-suppressiveandgrowth-regulatoryactivities．Itisregardedasabiochemicalindexbywhichsuper-earlypregnancyCanb