绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定学位申请人：刘静静指导教师：刘月琴教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩曰期二O—五年五月三十日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农此大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对

2、本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表小谢意。学位论文作者签名:签字f丨期：％ir年Z月入日学位论文版权使用授权书太学位论玄作者完令了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北•农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：士

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4、@’导师签名：^签字円期：>ijr年&月>円签字日期

5、：年/月〉闩学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编:分类号：S826单位代码：10086密级：学号：2012337绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定Preparationandidentificationofanti-sheepearlypregnancyfactormonoclonalantibodies学位申请人：刘静静指导教师：刘月琴教授学科专业：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月三十日基金项目资助国家肉羊产业技术体系，编号：CARS-

6、39摘要早孕因子（Earlypregnancyfactor，EPF）是母体受精后从血清中检测出最早与妊娠相关的蛋白，是与妊娠相关的免疫抑制因子，被认为是最早能确认妊娠的生化指标之一。在养殖生产中，利用早孕因子的特异性可以及时进行绵羊的妊娠诊断，减少其空怀发生，为提高生产效率提供重要意义。同时，EPF还可以跟踪妊娠母体中胎儿的发育情况，鉴定胚胎移植效果。目的：应用分子生物和细胞融合技术制备了绵羊早孕因子重组蛋白和单克隆抗体，为进一步研制早孕因子试剂盒奠定基础。方法：对表达菌pGEX4t-EPF-BL21（D

7、E）进行IPTG诱导剂，对诱导剂IPTG进行条件优化。将表达出的绵羊早孕因子重组蛋白（EPF-GST），通过亲和吸附层析柱对蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE进行鉴定。以纯化后的EPF重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠，免疫3次，每次免疫时间间隔为15天，后采用间接ELISA方法检测小鼠效价，取效价合格小鼠（N/P≧2）的脾细胞，将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，对杂交瘤细胞进行ELISA方法进行筛选，筛选出阳性杂交瘤细胞和细胞株。经有限稀释法将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，用G-sepharose柱亲合层析

8、法对小鼠腹水型抗体进行纯化，应用SDS–PAGE和Westernblot分析抗体纯化后的纯度及特异性。结果：在37℃下，表达菌最佳优化条件为：IPTG浓度0.5mmol/mL，诱导时间4h，在此诱导条件下表达菌能最大量表达绵羊EPF重组蛋白，重组蛋白分子量大小为26KD（其中早孕因子蛋白为10KD，标签蛋白为16KD），且该表达重组蛋白以可溶性形式存在。用纯化后的重组蛋白免疫小鼠，小鼠血清效价可达1：16000。取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到了1株抗绵羊EPF单克隆抗体的细胞株B4D5，效价为1：1

9、000。腹水型抗体经G-sepharose柱亲合层析，SDS–PAGE和Westernblot检测，得到纯度较高的单克隆抗体，且与绵羊EPF具有一定的特异性。结论：从表达菌中制备出了绵羊EPF重组蛋白（EPF-GST），以重组蛋白免疫小鼠，得到了绵羊早孕因子单克隆抗体。关键词：绵羊；早孕因子；单克隆抗体；ELISA；特异性PreparationandIdentificationofAnti-sheepEarlyPregnancyFactorMonoclonalAntibodiesAuthor:LiuJin

10、gjingSupervisor:ProfessorLiuYueqinMajor:AnimalGenetics,BreedingandReproductionAbstractEarlypregnancyfactorisapregnancyassociatedproteininserumafterfertilization,andtheproteinhasimmune-suppressive.Earlypregnancyfacto