绵羊肺腺瘤病毒受体hyal-2的原核表达及其多克隆抗体制备

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1、内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：彖彳砾日期：型丝』旦!鱼内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论

2、文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，采用影印，缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：柒考刍象越卸f甲、‘．’摘要目的：克隆绵羊肺腺瘤病毒受体h．rM-2基因全长，将其重组入原核表达载体中，构建重组质粒，进而转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，进行诱导表达，利用亲和

3、层析的方法纯化出Hyal一2蛋白，制备hyM一2的多克隆抗体，为进一步鉴定JSRV感染的组织细胞，探究JSRV的组织嗜性奠定基础。方法：本研究根据已报道的hyal-2基因序列，经primer5．0软件设计一对特异性的引物序列，利用PCR方法扩增hyaT-2基因序列，并将其重组入pGEX-4T-I原核表达载体中，构建pGEX一4T一卜hyal一2重组质粒，进行菌液PCR及测序，鉴定重组质粒构建的正确性。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经I、PTG诱导后进行10％SDS-PAGE电泳分析，检测融合蛋白的表达情况，经Westernblottin

4、g验证融合蛋白的表达。为了使GST—Hyal一2融合蛋白大量、稳定、高效地表达，本试验分别对重组菌表达GST—Hya]一2融合蛋白的IPTG诱导浓度、诱导时间、温度进行了优化，摸索最佳的表达条件。进而利用谷胱甘肽亲和层析的方法对目的蛋白进行亲和纯化，将纯化后的目的蛋白免疫家兔，制备Hyal一2蛋白的多克隆抗体，经双向琼脂扩散实验测定多克隆抗体的效价，经Westernblotting检测多克隆抗体的特异性。结果：利用PCR方法成功扩增出了囊阳』誓基因片段，大小为1431bp，测序结果显示hyal-2基因正确的插入到表达载体中，成功构建了pGEX一4

5、T一1-hyal一2重组质粒。重组菌经IPTG诱导表达了相应预期大小的Hya]一2融合蛋白，蛋白大小为80ku，Westernblotting也进一步验证了融合蛋白的表达。利用谷胱甘肽亲和层析的方法，纯化出了目的蛋白，利用Bradford法测得蛋白浓度为636．1∥g／mL，与佐剂充分乳化后，免疫家兔，制各出了兔抗Hyal一2蛋白的多克隆抗体。双向琼脂扩散实验结果显示，多克隆抗体的效价达到了1：16，经Westernblotting分析表明制备的多克隆抗体能够识别Hyal一2蛋白，且特异性较好。结论：成功构建了pGEX-4T—l-hyal一2重组

6、质粒，并在BL21(DE3)中诱导表达出了Hyai一2蛋白，免疫家兔制备出了绵羊肺腺瘤病毒受体hyal一2的多克隆抗体。关键词：绵羊肺腺瘤病毒：受体；透明质酸酶一2：原核表达；蛋白亲和纯化；多克隆抗体制备JaagsiekteSheepRetrovirusReceptorhyal一2ProkaryoticExpressionandPreparationofPolyclonalAntibodyAbstract0bjective：Toclonesheepvirus(JSRV)receptorhya，．2gene，prepareprokaryoticex

7、pressionvector,andthentransformitintoBL21(DE3)E．coli．Afterinducingexpression，obtain，punfyHyal-2proteinandpreparapolyclonalantbodyofHyal·2．IthasveryimportantacademicsignificanceforidentifingtheinfectedcellsofJSRVandtofurtherstudythetissuetropismofJSRV．Methods：Accordingtothepub

8、lishedsheephyal·2genesequence，apairofspecificprimerwasdesiged．Thegen