内源性绵羊肺腺瘤env基因的克隆和原核表达.pdf

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1、分类号S828学校代码10129UDC578学号08201053内源性绵羊肺腺瘤env基因的克隆和原核表达CloningandProkaryoticExpressionofEndogenousJaagsiekteSheepRetrovirusEnvGene申请人：苏佳学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：分子病理学指导教师：马学恩教授论文提交日期：二〇一一年五月摘要研究背景：内源性绵羊肺腺瘤病毒(endogenousjaagsiektesheepretrovirus,enJSRV)序列与外源性绵羊肺腺瘤病毒序列密切相关。在绵羊肺腺瘤病的发病过程中，虽然enJSRV不对O

2、PC的发生有直接地致瘤作用，但是在正常羊的个体发育过程中，enJSRV的表达可能会对exJSRV的感染和OPA（Ovinepulmonaryadenomatosis）疾病的发生有影响。实验目的：克隆内源性绵羊肺腺瘤病毒的env基因，将内源性env基因重组进入原核表达体系中，尝试诱导内源性env基因进行原核表达。为制备内源性env基因多克隆抗体奠定基础。研究方法：参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与3’长末端重复序列保守区序列设计引物，以正常地绵羊肺脏基因组为模板，应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤env基因与3’长末端重复序列；将克隆的内源性env基因

3、通过相应的酶切位点，亚克隆到原核表达载体pET-32a中，再转化入大肠杆菌BL21中后用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE分析内源性env基因编码的蛋白表达并应用Western-Blotting鉴定。用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白并应用WesternBloting鉴定。实验结果表明：利用PCR成功扩增内源性env基因与3’长末端重复序列，测序得目的片段长度为2249bp，与预期片段长度一致；内源性env基因在原核表达体系中可以少量表达，其原核表达蛋白的表观分子量为89kDa；对内源性env基因编码表达的蛋白质经Western-Blotting鉴定，实验成功表达内

4、源性env基因编码的蛋白；用镍柱纯化内源性env基因编码表达的蛋白，通过WesternBloting鉴定表明纯化结果仅有一条带。综上所述，在我国，此次实验首次克隆了内源性env基因，并将内源性和外源性env基因进行比较。尝试表达内源性env基因编码的蛋白质，为进一步研究env基因在绵羊肺腺瘤疾病的感染，疾病发生、发展中，以及内源性env基因在正常动物体内的生理功能与所起作用奠定小小的基础。关键词：内源性绵羊肺腺瘤；内源性env基因；克隆；原核表达CloningandProkaryoticExpressionofEndogenousJaagsiekteSheepRetrovir

5、usEnvGeneAbstractThesequenceofenJSRVandexJSRVhascloselyrelationship.InthediseaseprocessofOPAthoughenJSRVdoesnothavedirectlyactionintumorigeniceffects,intheindividualdevelopmentprocessofnormalsheeps,theexpressionofenJSRVmaybeaffecttheinfectionofexJSRVandthediseaseprocessofOPA.Ourtestistoclon

6、eendogenousenvgeneofenJSRV,andthenrestructuretheendogenousenvgeneintothesystemofprokaryoticexpression.Trytoinduceprokaryoticexpressionofendogenousenvgene.Settlebasisformakingpolyclonalantibodyofendogenousenvgene.Todesigntheprimeraccordingtotheconservativesubsequenceofenvgeneandlongterminalr

7、epeat(LTR)whicharepublishedinGenBankofendogenousjaagsiektesheepretrovirus,useedPCRtoamplificateendogenousenvgeneand3’LTR;BindedendogenousenvgenetopET-32avector,andthenrestructurethevectorintogenomeofE.coliBL21,andusedIPTGtoinduce;UsedSDS-PAGEtoanysisthep