犬表皮细胞生长因子的克隆和表达及活性鉴定

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1、分类号：墨墨§5UDC：农学硕士学位论文密级：——单位代码：!QQ2垦犬表皮细胞生长因子蹩克隆和表达及活性鉴作者姓名：杨传定指导教师：王雪敏教授’马志永研究员申请学位级别：农学硕士学科专业：动物遗传育种与繁殖所在单位：农学院授予学位单位：河北工程大学ADissertationSubmittedtoHebeiUniversityofEngineeringFortheAcademicDegreeofMasterofAgricultureCloningandexpressionandtheanalysisofthebiolog

2、icactivityofcanineepidermalgrowthfactor，一Candidate：YangChuandingSupervisor：Prof．WangXuemin：Pro￡MaZhiyongSpecialty：AnimalGenetics,BreedingandReproductionScienceCollege／Department：CollegeofAgricultureHebei叻iversityofEngineering一1—1一April，2013独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本

3、人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑兰垦墨壁盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：伟腱忍签字日期：沙侈年，月乃日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦墨猩盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权塑兰垦墨猩盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行

4、检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位⋯糍：钐馋炙鳓期：琊年j一月刃日导师签名：砂签字日期：≯彬年j，月矽日摘要表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是一种促进细胞增殖、分化和迁移的多肽。EGF能刺激细胞增殖、分化和迁移，参与一系列的生理过程如胚胎发育、组织再生、内分泌系统功能和调节、伤口愈合、胃液分泌等，并且在细胞信号传导过程中起重要做用，EGF及其受体对于肿瘤的

5、发生也有重要的关系。目前人表皮细胞生长因子已经广泛运用于医疗及化妆品等领域中，而犬的表皮细胞生长因子的研究开发，将对犬的医疗保健等方面有着重要的意义。1不同品种犬表皮生长因子基因的克隆与分子特征分析实验目的主要是克隆不同品种犬的表皮生长因子(canineepidermalgrowthfactor,cEGF)基因，分析不同品种犬EGF基因的分子特征及犬EGF与几种常见物种的EGF差异性比较。收集11个常见的不同品种犬的血样，提取基因组，采用PCR方法分别扩增出编码cEGF基因的N端和C端结构域的犬32号染色体20和2l号外

6、显子，插入pMDTM18．TVector，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5Q感受态，PCR鉴定阳性克隆后送样测序，用20和21号外显子序列拼接出cEGF全长，采用BLAST和DNAStar软件分析序列相互关系特征。结果成功扩增出11种不同品种犬EGF编码基因，全长为156bp，编码52个氨基酸，犬EGF基因序列同源性在97．4％．100％之间。根据cEGF编码基因推导氨基酸序列同源性为98．1％．100％，除了杜宾犬(Dobel'mailPinscher)EGF氨基酸在52位点处R—F，其余的氨基酸序列都一致。cEGF

7、氨基酸序列与几种其他动物及人EGF相比较发现：cEGF与家猫EGF(FeliscatusEGF)同源性很高，达到94．2％。结论不同品种犬的EGF编码基因同源性很高、非常保守，犬EGF与家猫EGF同源性很高。2犬表皮生长因子的原核表达、纯化、活性鉴定及多抗的制备用DNA重组技术合成犬表皮生长因子(canineepidermalgrowthfactor,cEGF)基因，在大肠杆菌中高效表达，检测重组蛋白的生物活性，制备cEGF兔源多抗血清。设计4条引物，用SOE-PCR合成cEGF基因，将cEGF基因克隆至表达载体pET-

8、24a、pET-28a进行原核表达，对表达得到的重组蛋白纯化，MTT法测定重组蛋白的生物活性，分析标融合签蛋白的大小对重组蛋白生物活性的影响。纯化后的rcEGF免疫日本大耳白兔，制备兔源多抗血清，用问接ELISA法检测所得多克隆抗体的效价。SOE．PCR合成得到cEGF基因，大小为156bp，编码52个氨基酸，构建了