趋化因子受体ccr胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

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1、趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定【关键词】因子Cloning,expression,purificationandidentificationofCCR5extracellulardomainrecombinantprotein【Abstract】AIM:ToconstructaprokaryoticexpressionvectorofCCR5extracellulardomainrecombinantproteinandtopurifyandidentifyit.METHODS:Toobta

2、inaminoacidsequenceofCCR5extracellulardomains,thefourpeptidesofCCR5werecombinedusingthesoftlinkerandnamedrCCR5.RCCR5genewassynthesizedaccordingtocodonpreferred.ThegenewasclonedintothevectorpET22bandtheaimproteinwasexpressedinTheexpressionproductwaspurifiedandthe

3、nidentifiedwithWesternblot.RESULTS:WedevelopedapurificationprocessofrCCR5frominclusionbodies.Theprocedureincludedwashingandsolubilizationofinclusionbody,purificationbySephacrylS300andrefoldingbySephacrylS100.The10/10resultofWesternblotshowedthespecificbindingofC

4、CR5mAbwithaimprotein.CONCLUSION:PurifiedrecombinantproteinrCCR5isobtainedsuccessfully,whichcanbeusedasacandidateantigenforCCR5autovaccinetochallengeHIV1infection.【Keywords】CCR5;PADRE;inclusionbodies;refolding;autovaccine;HIV1infection【摘要】目的：构建趋化因子受体5胞外段重组蛋白原核表达载

5、体，并进行诱导表达.对表达产物进行纯化和鉴定.方法：截取CCR5胞外结构4个片段NTerm，ECL1,ECL2和ECL3的氨基酸序列，应用柔性linker分别串联，模拟CCR5胞外结构，依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行Westernblot鉴定.结果：目的蛋白以包涵体形式存在，经包涵体洗涤、变性溶解，SephacrylS300凝胶过滤层析及SephacrylS100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质，目的蛋白能与CCR5mAb特异性结合.结论：获得了大量纯化

6、的rCCR5重组蛋白，可作为研制CCR5自体蛋白疫苗以阻断HIV1感染的候选抗原蛋白.【关键词】CCR5;人工手动HTL表位；包涵体;复性;自体疫苗;HIV1感染0引言10/10趋化因子受体5是HIV1感染初期病毒进入体内最重要的辅助受体［1］，近几年来，以CCR5为靶点的抗HIV1策略倍受关注，通过小分子拮抗剂、单克隆抗体及基因干涉等不同手段减弱或降低细胞表面CCR5的功能达到对抗HIV1感染的目的［2-5］.其中以CCR5为靶向的自体疫苗开辟了艾滋病疫苗研究的新途径［6］.CCR5自体疫苗通过诱导机体自身产生针对自

7、身分子CCR5的抗体进而与细胞表面的CCR5结合，降低细胞表面的CCR5的数量，减少了HIV1病毒感染的机会，达到预防HIV1感染的效果.我们构建人CCR5胞外段重组蛋白表达载体，对获得的重组蛋白纯化、复性.为构建CCR5自体蛋白疫苗提供实验依据.1材料和方法材料各种限制性内切酶、T4DNA连接酶；DL2000DNAmarker；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒；蛋白marker羊抗鼠二抗；小鼠抗人CCR5mAb.其他试剂均为国产分析纯.原核表达载体pET22b质粒为本室保存.宿主菌为大肠杆菌BL21.5L发酵罐.4℃高速

8、离心机、冻干机.凝胶柱填料SephacrylS300，SephacrylS100及纯化设备.方法10/10胞外段基因的合成分析SwissPro蛋白质数据库CCR5的结构，截取CCR5胞外4个片段NTerm,ECL1,ECL2,ECL3的氨基酸序列，分别为NTerm:MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAAR；E