TRAIL分子胞外段克隆表达及在CIA中的功能初探

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1、上海第二医科大学硕士学位论文TRAIL分子胞外段克隆表达及在CIA中的功能初探姓名：刘莉莉申请学位级别：硕士专业：医学免疫学指导教师：李宁丽2003.6.1上海第二医科土学硕士学位论文中文捕要TRAIL分子胞外段的克隆表达及在CIA中功能的初步探讨中文摘要TRAIL为II型跨膜蛋白，属于TNF家族分子。它可诱导某些敏感细胞的凋亡．包括肿瘤细胞与少数正常细胞。尽管TRAIL与其它TNF家族分子如TNF．a、FasL等在结构上存在同源性，但功能上却有很大差异，这主要表现在它选择性诱导多种肿瘤细胞的凋亡而保护大多数正常细胞免

2、于受损，突破了TNF—n、FasL等分子在体内应用的局限性。到目前为止，关于TRAIL对正常细胞中的作用虽未明确，但近来有关研究提示，TRAIL分子可以抑制活化T细胞的增殖与效能，且不表现为抗原特异性。与TNF、FasL不同，TRAIL并不是通过诱导活化T细胞的凋亡发挥效应的，而是通过阻断Ca2+离子内流从而抑制T细胞活化增殖及细胞因子的分泌。因此，TRAIL为那些因免疫调节紊乱与激活诱导的细胞死亡(activation—inducedcelldeath，AICD)障碍所导致的自身免疫性疾病如类风湿眭关节炎、多发性硬化

3、症、糖尿病、甲状腺炎、系统性红斑狼疮等的治疗带来新希望。为探讨TRAIL分子在类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)中的作用，本研究利用原核表达系统获得TRAIL的可溶性活性分子(sTRAIL)，通过在RA大鼠模型CIA(collageninducedarthritis，CIA)的应用来探讨TRAIL蛋白对RA可能的作用机制。获得大量纯化并具有生物学活性的sTRAIL蛋白是本研究的前提。人TRAIL蛋白全长为281个氨基酸(aa)，在体内其胞外段经过蛋白酶的水解形成可溶性分子，后者与其膜分子一样

4、通过形成三聚体而发挥正常的生物学功能。已有研究证明，原核表达的TRAIL分子胞外段为114．281aa，可在体外形成比较稳定的三聚体状态，且具有一定的生物学活性。因此，本研究中首先采用PCR方法克隆上海第二医科土学硕士学位论文中文捕姜编码人TRAIL114～281aa的基因片段，连接到T／A克隆载体，经过酶切与测序证实扩增得到的DNA的正确性。随即将目的片段经过双酶切后构建入表达载体，转染到宿主菌。经过小样表达筛选获得产量较高的菌株，然后大量扩菌并用溶菌酶与超声将其裂解，在非变性条件下通过Ni-NAT亲和层析得到His

5、6．sTRAIL目的蛋白，最后将洗脱液透析除去其中的咪唑。将TRAIL敏感的Jurkat细胞株与纯化的重组蛋白一起孵育，通过细胞凋亡的检测手段来检验重组蛋白的生物学活性。由于人与鼠TRAIL蛋白同源性高达65％，同时已有研究表明人源TRAIL(HuTRAIL)在体内可对鼠源肿瘤细胞发挥选择性杀伤作用，提示人与鼠TRAIL分子在功能上存在一定的交叉，这为我们采用HuTRAIL来探讨TRAIL蛋白在CIA中的作用提供了理论上的依据。RA是一种以滑膜组织中淋巴细胞、单个核细胞浸润，滑膜细胞增生，进而导致软骨、骨组织破坏的慢性

6、多关节炎，许多研究提示RA为T细胞介导的自身免疫性疾病。已知TRAIL分子可以抑制活化T细胞的增殖与效应，且TRAIL基因治疗在RA动物模型上取得了比较满意的结果。为进一步探讨TRAIL活性蛋白在RA中可能的作用，我们首先建立大鼠实验性RA动物模型CIA，即胶原诱导的关节炎模型。本研究中采用一次性尾根部与背部皮下多点注射鸡CII与福氏完全佐剂混合乳剂，成功诱导出Wistar大鼠CIA模型。大鼠在免疫后10．14天，后肢关节部位(末端关节为主)开始陆续出现红斑、肿胀，发病后10天左右症状达到高峰，严重时后肢拖地、行走障碍

7、，大鼠因疼痛与不便而表现为倦怠与营养不良等症状。CIA大鼠病患关节病理切片显示，滑膜组织内大量炎症细胞浸润，滑膜细胞增生、排列疏松紊乱，并可观察到增生的滑膜细胞与浸润的炎症细胞对正常软骨组织侵蚀的现象。为验证TRAIL对CIA的作用，我们筛选发病中期、关节炎指数相似的大鼠，在免疫后17天(关节炎指数达6～7分)采取患部注射TRAIL蛋白，对照组注射PBS，连续应用一周，然后观察一周。主要从大鼠关节炎指数评分、细胞因子TNF．旺、IFN吖与IL-4、IL．10的变化情况、及病理组织学鉴定结果来观察TRAIL应用于RA的具

8、体效果。实验结果显示，应用TRAIL上海第二匝科土学硕士学位论文十文摘要治：序组大鼠平均关节炎指数(MAI)虽然低于对照组，但无显著统计学差异(1)>O．05)。ELISA结果提示，TRAIL治疗组大鼠血清中TNF．o、IFN吖含量较对照组与正常发病组均有明显的下降，而IL一4、IL．10在各组的表达量都很低，无法观察其中的差异。