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《趋化因子受体ccr5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定论文【关键词】因子Cloning,expression,purificationandidentificationofCCR5extracellulardomainrebinantprotein【Abstract】AIM:ToconstructaprokaryoticexpressionvectorofCCR5extracellulardomainrebinantproteinandtopurifyandidentifyit.METHODS:Toobtainami
2、noacidsequenceofCCR5extracellulardomains,thefourpeptidesofCCR5（Nterm,ECL1,ECL2andECL3）edrCCR5.RCCR5geneproteininclusionbodies.TheprocedureincludedAbprotein.CONCLUSION:PurifiedrebinantproteinrCCR5isobtainedsuccessfully,，ECL1,ECL2和ECL3的氨基酸序列，应用柔性linker分别串联，模拟CCR5胞外
3、结构，依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行DYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAAR(31)；ECL1：YAAAQCQ(14)；ECL2:RSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQF(22).应用柔性linker（氨基酸序列为GGGGS）分别串联，获得模拟CCR5胞外片段的氨基酸序列(命名为：rCCR5)，按照已公布的人CCR5的基因序列，于5′端插入NdeⅠ酶切位点,.freelL含100mg/L氨苄青霉素（Amp）的新鲜LB培养液中,3
4、7℃摇床培养过夜,次日以1∶100接种于含100mg/LAmp的新鲜LB培养液中,37℃继续培养至细菌密度达到A600nm=0.4～0.6,1mmol/LIPTG诱导，4h后收菌，小规模培养及诱导后离心收集菌体,SDSPAGE检测目的蛋白的表达和存在形式.1.2.4工程菌的发酵从活化的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中,37℃培养10h,转种至含200mLLB的三角瓶中,37℃培养过夜.次日将种子液接种于5L发酵罐.控制发酵温度37℃，转速250～450r/min、通气量3～5L/min，pH7.3.培养至A600
5、nm=8时,1mmol/LIPTG诱导，继续培养4h,终止发酵,收集菌体、称质量，-20℃冰箱保存备用.取少量菌体处理后用SDSPAGE检测目的蛋白的表达.1.2.5目的蛋白包涵体的分离和洗涤取10g发酵菌体,按1g湿菌质量对7mL的比例,用裂解缓冲液STE(50mmol/LTrisHCl,pH8.0,50mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA)重悬,-20℃过夜.次日于室温水浴中融化,溶菌酶法裂菌，400ultipleextracellularelementsofCCR5andHIV1entry:Dissocia
6、tionfromresponsetochemokines［J］.Science,1996，274:1924-1926.［2］AgrapeptidelibraryfusedtoCCR5forselectionofmimetopesexpressedonthemammaliancellsurfaceviaretroviralvectors［J］.JBiolChem,2005,280(15):15195-15201.［4］QinXF,ChenIS,BaltimoreD.InhibitingHIV1infectioninhuma
7、nTcellsbylentiviralmediateddeliveryofsmallinterferingRNAagainstCCR5［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2003，100:183-188.［5］李文刚,邵沂,陈红.CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体的构建［J］.第四军医大学学报,2004,25(7):631-634.［6］ChackerianB,BriglioL,PaulSA,etal.InductionofautoantibodiestoCCR5inmacaquesandsub
8、sequenteffectsuponchallengeian/humanimmunodeficiencyvirus［J］.JVirol,2004，78(8):4037-4047.
