坎氏弧菌tlh溶血素基因的克隆表达、蛋白纯化及活性研究

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1、坎氏弧茵TLH溶独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得!洼；塑遗查墓丝重要挂别直明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：猢、嫡签字日期：矽／p年4月／oEl学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：l、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论

2、文的复印件和磁盘，允许论’．文被查阅和借阅。，。：：’：一。’‘’2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国。学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权：．。．。：。’’中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保．’．密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：围、葫导师签字：睁醍哞1签字日期：>OlO年牟月矽日签字日期：柳矿年够月矽日坎氏弧菌TLH溶血素基因的克隆表达、蛋白纯化及活

3、性研究捅要近年来，随着海水养殖业的不断发展，养殖病害呈加重之势，成为制约养殖渔业发展的首要问题之一。在养殖病害种类中以细菌性病害最为严重，其中又以弧菌属(Vibrio)的病原菌危害最大。弧菌病害流行面广、传播快、发病率和死亡率高，因而成为海水养殖病害研究的重点。坎氏弧菌(Vibriocampbellii)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的海洋细菌，是海水养殖动物的重要条件致病菌，可以引起养殖对虾暴发红腿病，鲍鱼患脓毒败血症等，该菌还与螺类和养殖幼鱼的发病相关，给海水养殖业造成了巨大的经济损失。由于对坎氏弧菌致病性的认识较晚，对其致病机理的研究还不够深入。溶

4、血素是致病弧菌中分布最为广泛的毒素之一，在病原弧菌的感染过程中发挥着多种重要作用。不同病原弧菌产生的溶血素虽然都具有溶血活性，但它们氨基酸序列、溶血活性及作用机理却有所不同。前期研究发现，坎氏弧菌中含有与哈维氏弧菌VHH溶血素基因序列非常相似的TLH溶血素基因，其核苷酸序列与哈维氏弧菌VIB645的vhhA和vhhB的相似性分别为79．81％和79．73％，其氨基酸序列与VHH溶血素相似性为85％，且这两种溶血素均在147-406位氨基酸处有一个脂酶结构域(Lipase_GDSL)，推测这一类溶血素是磷脂酶。本研究克隆表达了坎氏弧菌的f腑基因，重组表

5、达后，利用Ni一柱进行纯化：分析了纯化的TLH溶血素的溶血活性以及该溶血素受温度、pH和金属离子的影响，并进一步研究了TLH溶血素对斑马鱼的致病性。本研究设计了一对特异性引物，自坎氏弧菌基因组上扩增出tlh溶血素基因(1254bp)：将PCR产物连接到表达载体pET一26b(+)，构建了坎氏弧菌TLH溶血素基因的重组表达质粒pET26b(+)／tlh，并转化大肠杆菌BL21(DE3)；加入终浓度为lmM的IPTG诱导重组菌表达带有6个组氨酸标签的TLH融合蛋白。诱导后的重组大肠杆菌及其培养上清液在新鲜牙鲆血平板16。C过夜及卵磷脂平板37。C过夜培养

6、，培养结果显示诱导后的菌体及上清液分别具有溶血活性及磷脂酶活性。SDS-PAGE分析显示，该溶血素在重组大肠杆菌中能够大量诱导表达，分子量约为42kba。利用Ni琼脂糖亲和层析柱对重组的坎氏弧菌TLH溶血素进行纯化，纯化的TLH溶血素在SDS-PAGE电泳图上为单一蛋白带；利用Bradford法绘制标准蛋坎氏弧菌ILH溶血素基因的克隆表达、蛋白纯化及活性研究白曲线，得到纯化的丁LH溶血素的浓度为0．41mg／mL。溶血素活性实验表明，纯化的TLH溶血素具有较强的溶血活性(溶血圈直径为16mm)及磷脂酶活性(浑浊内圈直径为llmm，透明外圈直径为15r

7、am)。TLH溶血素溶血活力的最适温度为37。C；温度稳定性检测显示，在小于37。C时较稳定，45。C下孵育30rain其活力损失50％，55。C下孵育30min其活力损失75％，75。C下孵育30min即完全丧失溶血活力，证明坎氏弧菌TLH溶血素是热不稳定性溶血素。TLH溶血素的最适pH为6，在pH为5和7时，只有50％的活力，且TLH溶血素在pH5一10较稳定，pH大于10或小于5时都会导致其稳定性迅速下降。本实验中10种金属离子洲a+，K+，M92+，Ca2+，Mn2+，C02+，Ni2+，Cu：+，Zn2+和Ba2+)对坎氏弧菌TLH溶血素溶

8、血活力的影响结果显示，一价金属离子如Na+、K+对溶血活性几乎没有影响，而部分二价金属离子如Ca2+、C02