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《人纤溶酶原k1-3基因克隆、表达和产物纯化及抗癌活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#$%%$年&月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12,-./-01-2$%%$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!人纤溶酶原!"#$基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析张添元罗进贤"陆幸妍（中山大学基因工程教育部重点实验室，生物化学系，广州#!%$5#）摘要纤溶酶原F!39功能区是近年发现的血管生成抑制因子，具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素@G+H为模板用IJK
2、技术扩增了F!39功能区的基因，G+H序列分析后克隆至质粒.ILJ&F上获得重组质粒.ILJ&F!9，转化毕节酵母M,!!#，用IJK和M4!"法筛选高拷贝转化子，进行摇瓶发酵。,G,3IHM=和N-?/-2E1)(/分析结果证实F!39基因已在M,!!#分泌表达，并具有免疫活性。选用9%O和"%O罐进行高密度发酵，甲醇诱导4"P细胞密度达到34$#%Q9%%，比摇瓶提高#Q6倍，表达量!#%3$%%0RSO。发酵上清液经,/2-;0)>E-,I离子交换及IP-3ET)3,-.P(2(?-疏水层析纯化，在,G,3IHM=上显示一条带
3、，纯度&6U，动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。关键词人纤溶酶原F!39，基因克隆和表达，纯化，抗癌活性中图分类号V5"文献标识码H文章编号!%%%39%6（!$%%$）%#3%#&93%4血管生成是肿瘤组织得以快速生长和转移的基赤酵母5#0"#+6+&/(*#&M,!!#及.ILJ&F购自LEZ>/2(3［!］础。利用高效低毒的血管生成抑制因子抑制新生R-E公司。血管的形成，切断肿瘤的营养供应，达到治疗肿瘤的"%"%&酶和主要试剂：限制酶，84G+H连接酶，［$Q9］目的是当前肿瘤领域研究的热点之一。!&&4年D+
4、8I?，IJK试剂盒购自K(@P-公司，人纤溶酶原抗发现的纤溶酶原的F!34功能区是一个血管生成抑制血清为,>R0;公司产品，IJK引物由北京赛百盛公因子，它通过抑制血管生成来抑制肿瘤的生长和转司合成，纯化用的,/2-;0)>E-,I，IP-ET)3,-.P;2(?-等［4］移。后来又发现其F!39功能区比F!34区有更强的填料为H0-2?P;0IP;20;@>;[>(/-@P公司产品。抗血管生成和抗肿瘤活性。F!34功能区的研究国外"%"%$培养基：大肠杆菌的培养用O[培养基，酵母已开始进入一期临床阶段，国内研究尚在实验室规培养基
5、IG，]G，]]，[]M及[]]见文献［6］。模，F!39功能区的研究国内尚无报道。毕赤酵母"%&方法（5#0"#+6+&/(*#&）是一种甲基营养酵母，它能以甲醇为"%&%"IJK扩增：以人血管生成抑制素@G+H为模唯一碳源和能源。在以甲醇作碳源时与甲醇代谢有板，扩增条件为：&4^!0>E，6%^!0>E，5$^!0>E，反关的酶如醇脱氢酶（HWX）等能大量地表达。由于这应9%个循环。类酵母具有能高密度发酵，遗传稳定，发酵液中分泌"%&%&IJK产物的克隆和序列分析：IJK产物先克的杂蛋白质少，易纯化和糖基化形式较接近人类的
6、优隆至质粒.,I5$，用I-2_>E=)0-2公司的全自动G+H点，是新一代的酵母表达系统。本文报道人纤溶酶原序列分析仪进行序列测定。序列正确的G+H再克F!39功能区基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表隆到质粒.ILJ&F上。达，高密度发酵，产物的纯化和生物活性分析。"%&%$酵母的转化，阳性转化子和高拷贝转化子的筛选均按文献［6］的方法进行。"材料与方法"%&%’F!39基因的表达，电泳，免疫印迹分析：高拷"%"材料贝阳性转化子单菌落接种，培养至346%%‘$Q6后"%"%"菌种与质粒：大肠杆菌GY#!为本室保存，毕用甲醇诱导，上
7、清液进行,G,3IHM=及N-?/-2E1)(/收稿日期：$%%$3%43$5，修回日期：$%%$3%63$4。基金项目：广州市“$$#科技工程”重大项目资助（+(*&&373%%43%!）。"通讯作者。8-)："63$%3"4!!$9&5；:;<："63$%3"4%96$!#；=30;>)：)?12@%$AB?C*-DC*@E3?@生物工程学报9*卷分析。#"()*+,-&!(的转化和阳性转化子的筛选!"#"$高密度发酵：在德国的!"!#$%&’()和*()用&’(!（或)*("）酶切=,2-?89’使之线性反应器中进行，发酵条件
8、参考文献［+］。化，然后采用原生质体转化法将=,2-?89’转化+E!"#"%产物的抗血管生成和抑癌活性分析按文献,*-.#/0-6>993，先用,-.快速检测筛选阳性转化子［*］的方法。然后点种到分别含9R@KDSK)6@9*的T,
