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1、人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定作者：小小小作者：陈武，莫炜，张艳玲，宋钢，宋后燕【摘要】目的研究人纤溶酶原kringle区缺失突变体(PLGAK)的毕赤酵母(Pichiapastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用7.5L发酵罐对工程菌PLGAK/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测PLGAK等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S2403分别测定PLGAK激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果7.5L高密度发酵可获得约为4
2、00rng/L培液的表达量，经三步纯化后制备的PLGAK纯度大于96%o理化分析显示PEGAK的等电点为7.5〜7.8,分子量：27.787kD,比活性：23.6U/mgo结论初步建立了PLGAK的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近，具备放大生产和应用的潜力。【关键词】毕赤酵母kringle区纤溶酶原缺失突变体纯化AbstractObjectiveToinvestigatetheexpression,purificationandcharactersofthekringledomaindeletionmutantofhumanplasmin
3、ogen(PLGAK)inPichiapastoris.MethodsFermentationathighdensity(A600>200)ina7.5LfermenterwascarriedoutandPLGAKwaspurifiedfromtheculturebrothinathreestepprocess:ultrafiltration,gelfiltration,ionexchangechromatography,andwaslyophilizedafterdialysis.TheIFE,HPLCandLCMSwereusedtodetectitsisoelec
4、tricpoint(IP),purity,andmolecularweight(MW).ThefibrinolyticactivityandamidolyticactivityweremeasuredwithfibrinplateandchromogenicpeptidesubstrateS2403respectively.ResultsFermentationin7.5Lscaleyieldedanexpression1evelofapproximate!y400mgPLGAKper1iterfermentationbroth.Throughthreestepsofp
5、urification,thePLGAKhadapurityofover96%.TheexactMWofPLGAKwas27.787kDexaminedbyLCMSanditsIPwas7.5-7.8.ConclusionApilotexpressionandpurificationtechnologyofPLGAKinPichiapastorisculturedathighdensityhasbeensetup.Theactivitiesofintermediateproductionarecomparabletothatofplasminogenextractedf
6、romhumanplasma,indicatingagoodperspectiveinscaleupandapplication.Keywords:deletionmutant;kringledomain;Pichiapastoris;plasminogen;purification人纤溶酶原（plasminogen,PLG）是人体纤溶系统的主要成分，在体内经纤溶酶原激活剂（plasminogenactivator,PA）激活后，转变为纤溶酶（plasmin,PLM）,不仅发挥溶栓作用，还参与体内一•系列与蛋白水解有关的生理病理过程，如炎症、组织修复、排卵、肿瘤侵袭和转
7、移等。长期以来，纤溶酶被认为是一种具有潜力的直接溶栓药物，但由于分子量大、结构复杂、富含糖链且易自身降解，采用大肠杆菌、哺乳动物细胞表达效率较低[1,2],因此对PLG进行结构改造是近年来研究的热点。本室宋钢等采用毕赤酵母表达了一种纤溶酶原kringle区缺失突变体（PLGAK）,经激活后，具有较好的纤溶活性[3]o本实验在此基础上，深入研究了高密度发酵和纯化工艺，使其更适合大规模制备，并对其理化性质进行研究，为纤溶酶的开发利用提供了实验基础。1实验材料毕赤酵母表达菌PLGAK/GS115由实验室自行构建;纤溶酶、纤溶酶原、三肽化合物S2
