人纤溶酶原水解片段kringle5突变体表达纯化及抗血管增生功能研究

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1、分类号VDC硕士学位论文密级人纤溶酶原水解片段kringle5突变体表达纯化及抗血管增生功能研究”■●⋯l■●●ExpressionandpurilicationaudantlanglogenlCfunctionresearchofthehumanplasminogenkringle5mutant作者姓名：王小文学科专业：肿瘤学学院(系、所)：湘雅医院指导老师：钟美佐教授中南大学二O一二年十一月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文

2、中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：业年止月么日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供

3、信息服务。作者签名：拯师签作者签名：乏芝坦导师签趣坐月么日硕士学位论文中文摘要摘要目的：在细胞水平探讨GST标签的人纤溶酶原Kringle5基因工程蛋(了(GST-K5m)抗血管增生的作用。方法：利用primerpremier5。0引物设计软件，PCR法得到K5m基因，再利用基因工程技术，将目的基因克隆至pGEX．4T-3的BamHI和XhoI位点。再将该pGEX．4T-3依5m重组质粒转染到BL21(DE3)宿主菌中，表达出可溶性重组蛋白。采用GST树脂亲和纯化融合蛋白，对纯化的融合蛋白进行SDS．PAGE电泳和Western．

4、blot分析鉴定，结果显示得到分子量约为37kDa的融合蛋白。为了验证GST-K5m融合蛋白是否具有生物学活性，用不同浓度的(25．1280nmol／L)GST-K5m融合蛋白分别处理人脐静脉内皮细胞(HLWECs)、肝癌细胞(Bel7402)和正常肝细胞fr儿c)，MTT法检测各组的细胞抑制率，PI单染法和hoechst33258染色法标记各组凋亡细胞。用不同浓度的GST-K5m融合蛋白及His6．K5重组蛋白处理HUVECs，接着用transwell实验检测GST-K5m融合蛋白对人脐静脉内皮细胞迁移功能的影响。结果：GS■K

5、5m融合蛋白可抑制人脐静脉内皮细胞(m舰Cs)的增殖，呈浓度依赖关系，但是对肝癌细胞和正常肝细胞存活率无明显影响；GST-K5m融合蛋白对正常肝细胞(NLC)和肝癌细胞(Bel7402)无明显凋亡诱导作用，但具有诱导内皮细胞凋亡的作用；GST-K5m融合蛋白及His6．K5重组蛋白均抑制HUVEC的迁移。结论：1、构建了pGEX．4T-3／K5m重组质粒，并获得带GST标签的GST-K5m融合蛋白。2、体外实验证实，GST-K5m重组蛋白可特异性的抑制血管内皮细胞增殖和迁移，并诱导内皮细胞的凋亡，且对肝癌细胞和正常肝细胞无明显的效

6、应。关键词人纤溶酶原K5；血管增生；凋亡II硕士学位论文英文摘要ABSTRACTobjective：ExplorettheantiangiogeniceffectoftheK5mutantproteinGST-K5mfusionproteinatthecellularlevel．Methods：Usetheprimerprimor5．0software，PCRmethodgettheKSmgenesandcloningthepurposegeneintothepGEX-4T-3plasmidBamHIandXhoIrestrict

7、sitebyusinggeneengineeringtechnology．ThepGEX-4T-3／KSmwasintroducedintoE．colistrainBL21(DE3)andsolubleproteinswerereleased．TheproteinswereexaminedbySDS-PAGEandwesternblotanalysisusinganantibodyspecifictoGST-tag，andtheresultsshownthatthemolecularweightofabout37kDagetthe

8、protein．InordertovalidatethebiologicalactivitiesoftheproteinGST-K5m，weusedifferentconcentration(25～1280nmol／L)GST-K5mprotein