吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中表达及纯化的研究

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1、西南大学硕十学伊论文摘要吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达及纯化研究生物化学与分子生物学专业硕士研究生苏畅指导教师刘堰教授摘要吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Bat-PA)．来源于南美洲吸血蝙蝠(Desmodusrotundus)的唾液，是～种t．PA类似物。该类似物共有四种形式，分别为：DSPAal、DSPAo．2、DSPAp、DSPAy，其中对DSPAal(Bal．PA(H))的研究最多，其纤溶活性也最高，DSPAal是由477个氨基酸组成的高分子蛋白，与t-PA分子有85％的同源性，区别在于它

2、不具有t-PA分子的kringle2区和纤溶酶切割位点。与toPA相比较，DSPAal的血纤蛋白依赖性和选择特异性更高。当血纤蛋白存在时，DSPAal的催化活性提高45000倍，而t-PA仅提高205倍。动物实验证明，重组的Bat-PA的溶栓速度比重组的t-PA更快，对血栓中血纤蛋白选择性更强，持续的时间更长。同时，在给药后，Bat．PA致使血纤蛋白原、纤溶酶原、毗．抗纤溶酶下降的比例都明显低于t-PA，还发现t-PA用药后有高分子质量的血纤蛋白原降解产物片段的积累，而Bat-PA用药后不发生这类片段的积

3、累。关于纤溶酶原和因子VHI的变化，也表明t-PA导致其下降，而Bat—PA不明显。这些实验特征都显示BabPA极有可能开发成为一种溶栓速度快、血栓选择性高、出血副作用小的新硝纤溶酶原激活剂类溶栓药物。目前。Bat-PA主要来自哺乳动物细胞的表达，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、非洲绿猴肾细胞(COS)，其代价昂贵，表达量也偏低。希望利用毕赤酵母表达系统对Bat．PA进行生产，降低其成本，提高产率，为使Bat．PA成为急性中风的一种候选药物作初步的探索。本课题在体外人工合成吸血蝙蝠唾

4、液纤溶酶原激活剂Bat-PA(H)的全长基因，并在基因序列5’和3’端分别引入His6，再将其克隆到表达载体pPIC9K上，成功构建出His6一Bat-PA／pPIC9K和Bat-PA．His6／pPIC9K重组质粒。然后，将构建的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GSll5中，经过(}418浓度梯度抗性筛选、小量表达后经SDS—PAGE电泳检测及纤溶平板测活，获得高拷贝高表达的Bat—PA酵母菌株。利用单一实验和正交实验对Bat—PA酵母菌株的发酵过程中的五个因素(发酵液pa、甲醇补加量，发酵密度、发酵时间、

5、通气量)进行优化，获得一个较优的发酵表达条件：pH=5．5，补加甲醇量2．0％／24h，4：1接种，96小时发酵，10／50通气量。通过甲醇诱导分泌型表达获得重组的带His-tag的Bat-PA蛋白，其分子量约为66KD。由于His．tag的存在，经过Ni2‘亲和层析柱纯化，最终可从每升发酵液中获得20—30mg目的蛋白，并利用纤溶平板法对纯化得到的蛋白进行纤溶活性分析。关键词：巴斯德毕赤酵母吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂纤溶平板法Ni2+亲和层析柱西南大学硕十学何论文AbstractTheStudyonVa

6、mpireBatSalivaryPlasminogenActivatorinPichiaPastorisPostgraduateofBiochemistryandmolecularbiology：SuChangSupervisor：ProfessorLiuYanAbstractVampirebatsalivaryplasminogenactivator(Bat-PA)，whichcomesfromthesalivaofvampirehat(Desmodusrotundus)inSouthAmerica,n

7、amedDSPA，ishomologoustotissuetypeplasminogenactivator(t-PA)．ThemarefourdifferentDSPAscomprisingDSPAnl，DSPAa2，DSPApandDSPAT，inwhichDSPAal(Bat-PA0t)，thefull—length)hasbeenpreviouslydescribedmost．DSPAalisconstitutedof477础oacids．ThesequencesofDSPAnIandt-PAare

8、85％identical．Itcontainsneitherakringle2domainnoraplasmin-sensitiveprocessingsite．DSPAaldependsmoreonfibrinandhasahigherspecificity．Thecatalyticactivitytowardplasminogenisstimulated45000-foldinthepresenceoffibrin,the