江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化与其鉴定

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1、江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化及其鉴定英文缩写bpCDNADNAdNTPEBE．coliGlyHiSHHRPIPTGkDaKanLBM’mlnmMmgmlODPAGEPBSPCRI州ARNaserpmSDS英文缩写索引英文全称basepaircomplementaryDNAdeoxyribonucleicaciddeoxybrbonuclesidetriophosphateethidiumboromideEscherichiacoliglycinehistidinehourhorseradishperoxida

2、se中文全称碱基对。互补脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸三磷酸脱氧核苷溴化乙锭大肠埃希菌甘氨酸组氨酸小时辣根过氧化物酶IsopropyBDthiogalactopyranoside异丙基BD硫代半乳糖苷kilo-daltonkanamycinluria—bertani(culturemedium)MolarperliterminuteMillimoleperlitermilligrammilliliteropticaldensity千道尔顿卡那霉素LB培养基摩尔／升分钟毫摩尔／升毫克毫升光密度Polyacrylamidegelel

3、ectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳phosphatebufferedsalinepolymerasechainreactionribonucleicacidribonucleaseroundsperminutesodiumdodecylsulfate磷酸盐缓冲液聚合酶链反应核糖核酸核糖核酸酶每分钟转数十二烷基磺酸钠43江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化及其鉴定SeCII1TAEbufferTriSUsecondmicroliter秒微升．tris—glacialaceticacid—EDTA乙酸二乙胺四乙

4、酸缓冲液tris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷unit单位学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名(手写)：垒童鱼导师签名(手写)逊年学位论文版权使用授权书：fC1j劫氩易6弓V日本学位

5、论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)作者签名(手写)：鱼墨弛加P年—生月』日江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化及其鉴定摘要目的采用基因工程技术，构建江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂(plasminogenactivatorofG]oydiusbrevicaud

6、usvenom，GBV-PA)原核核表达载体(pET42a(+)一GBV-PA)，并在大肠杆菌中的表达。为编码GBV—PA的基因克隆在大肠杆菌细胞中进行有效表达，批量生产GBV—PA；同时为研究GBV—PA的基因和蛋白质、结构和功能的关系及其作用机制创造条件。方法．根据己知竹叶青蛇毒纤溶酶原激活剂(TSV二PA)基因的核苷酸序列设计上游引物，含EcoRI酶切位点，和下游引物，含XhoI酶切位点。以提取的江浙短尾蝮蛇毒腺总RNA为模板，RT--PCR方法合成扩增其中的纤溶酶原激活剂基因序列，将GBV-PA基因定向克隆到原核表

7、达载体pET42a(+)中，经EcoRI／XhoI双酶切鉴定后，热激转化至宿主菌BL21(DE3)，测序鉴定。IPTG诱导rGBV—PA融合蛋白表达，SDS--PAGE凝胶电泳鉴定表达产物；HiS亲和层析柱纯化融合蛋白rGBV-PA，Westernblotting方法鉴定表达产物的抗原性。结果．1．RT--PCR扩增得到的cDNA为800bp左右，与预期GBV—PA基因大小基本一致。2．构建的表达质粒pET42a(+)一GBV—PA，经双酶切和测序鉴定证实GBV—PA基因已正确插入质粒载体的多克隆位点。得知GBV—PA的c

8、DNA大小为777bp，推导出的氨基酸数目为259个，MW=27921。GBV-PA与TSV—PA核苷酸序列同源性为90．13％，氨基酸序列同源性为81．92％。3．在大肠杆菌BL21中成功表达融合蛋白rGBV—PA，SDS--APGE凝胶电泳显示rGBV—PA主要以包涵体形式存在，分子量约61．7kD