生物制药论文-组织型纤溶酶原激活剂

生物制药论文-组织型纤溶酶原激活剂

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时间:2018-07-15

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1、1 引言(或绪论)组织型纤溶酶原激活剂(TissueTypePlasminogenActivator,t-PA)激活纤溶酶原形成纤溶酶,是体内纤溶系统的生理性激动剂,在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用,是一种新型的血栓溶解剂。t-PA在组织和体液中含量甚微,分子量很大,从天然组织提取或人工合成药用t-PA均有很大难度。本实验运用基因工程手法,从人胎盘染色体基因库中筛选出TPA基因,将其雨质粒结合,导入到人黑色素瘤细胞当中,组建能够表达t-PA基因的工程细胞。然后将人黑色素瘤细胞无血清连续培养,并运用

2、高效诱导剂,从而快速、大量地获得了含组织型纤溶酶原激活剂(tPA)水平较高的培液。经免疫亲和层析、SephadexG-150凝胶过滤,培液中t-PA得以快速有效地纯化。将纯化后的tPA与WHO标tPA抗体作免疫鉴定。2 组织型纤溶酶原激活剂简述2.1组织型纤溶酶原激活剂原激活剂(PA)是以丝氨酸为活性中心的蛋白酶。它能将纤溶酶原转化为纤溶酶,在纤溶系统中有重要作用。同时,PA与细胞转移、血液凝固、组织重建、激欣产生及原发性肿瘤的发生等生理和病理生理现象有密切的关系。人纤溶酶原激活荆有尿激酶型(uPA)及组织型(

3、tPA)两种主要类型。这两种蛋白质免疫性不同,分子量有区别,由不同的基因编码。tPA主要是由血管内皮细胞合成的单链多肽,分子量约为68000,在纤溶酶或胰蛋白酶作用下,水解Arg275-Ilu276肽键,形成由二硫键连接的双链结构。氨基末端在重链,羧基末端在轻链。重链有两个三角区结构,并有与纤维结合素指形结构有同源性的区域和生长因子样区域等。轻链含有由His(322)}、Asp(371)、Ser(478)组成的酶活性中心。tPA对纤维蛋白原亲和力很低,对纤维蛋白亲和力极高,.tPA-纤维蛋白复合物能高效且特异地

4、激活血凝块中的纤溶酶原,形成纤溶酶,后者溶解血栓中的纤维蛋白,但几乎不激活循环血液中的纤溶系统,因此,tPA是一种较为理想的血栓溶剂。2.2 组织型纤溶酶原激活剂基因1983年,Pennia等成功地构建了编码tPA的完整cDNA第5页,共5页克隆,并在大肠杆菌中进行了表达。该克隆的tPAds-cDNA的限制性内切酶位点,也同样出现在tPA基因中。Ny的tPA基因,用限制性内切酶水解,琼脂糖凝胶电泳,与tPA探针作Sou-there固相分子杂交,然后将阳性片段克隆到M13,mP8mP9中,进行顺序分析,显示了有以

5、下结构特征;tPA基因至少由13个内含子分隔为14个外显子,每一个内含子5'端以G-T开始,3’-端以A-G结束。tPA基因的14个外显子,分别编码tPA各个功邻区域。2.3 tPA基因的染色体定位tPA基因以单拷贝存在于染色体中。1985年,Rajput等人用人-鼠体细胞融合,进行基因转移,研究tPA与uPA基因的染色体定位。他们用限制性内切酶Hind}I分别消化人和鼠染色体DNA,将水解片段与tPAcDNA探针杂交,结果为tPA探针与人DNA/Hind耐班的强杂文带为7kb,与鼠DNA/HindⅢ的强杂交带

6、为23kb。然后他们随机选择了32个不同的融合细胞,其细胞DNA/Hind与tPA探针杂交的结果为:32个细胞中都有23kb条带,18个细胞中尚有7kb强杂交带。其余24个融合细胞中7kb强杂交带消失。进一步作染色休组型核型鉴定发现:含有7kb杂交条带的18个融合细胞中都有第8对染色体,而24个不含7kb条带的融合细胞中均不存在第8对染色体。因此证明人SPA基因定位于第8对染色体t77。用同样的方法,他们又确定了人uPA基因定位于第10对染色体。这个结论与过去提出的PA基因定位在第6对染色体是不相同的。3 t-

7、PA工程细胞的制备3.1 tPAcDNA探针的制备本设计采用改良的Birnboim方法。大量制备tPAcDNA片段的重组质粒pHS-2,经Sepharose2B柱分离,获得纯化质粒。Pst水解pHS-2质粒,经1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收其中tPAcDNA片段,按NBN公司切口平移翻译药箱推荐的反应条件,以α-32PCTP标记tPAcDNA片段,用液体闪烁计数仪测定探针的放射性强度,计算比放射性。第5页,共5页3.2 人胎盘染色体基因库优选将人胎盘染色体基因库重组DNA随机分为7个组份,每份取一定量用EcoRI

8、消化2h,经碱变性后与tPAcDNA探钦点杂交,探针强度为5x105-106cpm/ml杂交液,50℃杂交(5xSET;5xDenhardt's;0.1NapyPO4;O,1%SDS;10%Na-Dextransulfate,鱼精DNA100-200ug/ml杂交液)20h。滤膜用2xSSC,0.1%SDS溶液50℃洗涤3次,室温下洗2次,然后进行X光胶片放射自显影。3.3 人tPA基

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