组织型纤溶酶原激活剂膜联蛋白A5融合基因的构建

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1、汕头大学医学院硕士学位论文中文摘要[研究背景]血栓性疾病是指继发于（或并发）血栓形成的疾病，形成的血栓常阻塞局部血流或脱落成栓子堵塞下游血流造成血栓栓塞从而引起组织缺血和坏死进而影响器官功能。据世界卫生组织统计，目前血栓性疾病的死亡率已跃居全球疾病总死亡率的首位，成为严重危害人类健康的疾病，因而防治血栓形成已经引起了医药学界的高度重视与普遍关注。溶栓治疗是治疗血栓性疾病的主要方法，通过应用溶栓药物激活纤溶酶原（plasminogen，PLG），使之转变为纤溶酶（plasmin，PL），进而溶解血栓中的纤维蛋白，最终使血

2、栓溶解。组织型纤溶酶原激活剂（tissueplasminogenactivator,tPA）是一种丝氨酸蛋白酶，为最主要的生理性纤溶酶原激活剂，可通过其赖氨酸残基选择性地与血栓表面的纤维蛋白结合，激活血栓中已与纤维蛋白结合的PLG，使之转变成PL，继而溶解纤维蛋白，使血栓溶解。目前，tPA已广泛应用于血栓性疾病的治疗。但由于tPA溶栓的特异性不强，相当一部分患者在应用tPA后仍表现为出血倾向。因此，寻找更为特异的溶栓药是必要而且迫切的。2+人膜联蛋白A5（annexinA5）是一种Ca依赖性、结合带负电荷磷脂表面的通道

3、蛋白，分2+子量约34kDa，主要存在于细胞膜和内质网膜上。它具有抗凝血活性，在Ca存在下，annexinA5和裸露在活化血小板膜表面的磷脂酰丝氨酸具有高度的亲和力，因而可以将annexinA5作为一种靶向剂，将溶栓药靶向到富含血小板的血栓。出于这一设想，本研究设计并构建了tPA-annexinA5融合基因，并为以后该融合基因在体外转染CHO细胞系，在CHO细胞中表达tPA-annexinA5融合蛋白打下基础。[目的]本研究的目的是提供一种具有抗凝及特异性溶栓活性的溶栓药组织型纤溶酶原激活剂-膜联蛋白A5融合蛋白基因的

4、设计和制备方法。本研究的另一目的是为下一步获得初步纯化的融合蛋白，以此作为一种新型溶栓药应用于临床上血栓性疾病的治疗。[材料和方法]本研究的实施方案通过下述方法和步骤进行：1.tPA基因和annexinA5基因的获得I汕头大学医学院硕士学位论文从广州复能基因有限公司购买含有tPAcDNA的质粒pOTB7-tPA，转化大肠杆菌JM109，氯霉素筛选后挑阳性菌落，37℃过夜培养，送1ml菌液到大连Takara公司测序，将测序结果pOTB7-tPA中的tPA基因序列与NCBIGenebank中的BT007060(1689bp

5、)比对。含有annexinA5基因的pcDNA3.1-annexinA5由高福禄教授馈赠，转化大肠杆菌JM109，氨苄青霉素和新霉素筛选后挑取阳性克隆，摇菌培养，送1ml菌液到大连Takara公司测序，将测序结果中annexinA5基因序列与NCBIGenebank中的NM_000930序列比对。2.tPAcDNA的扩增以PrimerPremier5.0软件依据人tPA的保守序列设计特异性引物，其正向引物5’端引入HindIII酶切位点，其反向引物5’端引入KpnI酶切位点，反向引物与KpnI酶切位点之间加上柔性寡肽基

6、因序列。按设计合成引物，从含有tPA基因的质粒载体pOTB7-tPA中用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）的方法扩增tPAcDNA，1%琼脂糖电泳鉴定。3.tPAcDNA的T-A克隆将扩增的t-PAcDNA按Invitrogen公司的pCR®2.1-TOPO载体说明书亚克隆入pCR®2.1-TOPO，构建pCR®2.1-TOPO/tPA，继之转化TOP10大肠杆菌，加50μg/ml氨苄青霉素和40mg/mlX-gal，蓝白斑筛选，挑阳性菌落（白斑）扩增培养，提取质粒，1%琼脂糖凝胶

7、电泳鉴定。4.pcDNA3.1-tPA-annexinA5的构建将质粒pCR®2.1-TOPO/tPA和质粒pcDNA3.1-annexinA5以HindⅢ及KpnⅠ双酶切后，1%琼脂糖电泳，电泳显示酶切后的tPA和开环pcDNA3.1-annexinA5；在紫外光下切琼脂糖凝胶回收目的DNA条带，以DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA，以此来提高目的DNA片段的纯度，琼脂糖电泳鉴定是否回收到足够多的目的DNA。以QuickT4DNA连接酶连接切胶回收的上述两个DNA片段，转化JM109大肠杆菌，提取质粒，电泳初步鉴定是

8、否获得目的质粒；重新双酶切后电泳鉴定是否符合tPA和pcDNA3.1-annexinA5的分子量。5.测序及序列比对将符合设计要求的连接转化后提取的质粒送Takara公司测序，在NCBI上的Blast软件和单机软件DNAMAN进行序列比对，看是否完全符合设计要求。II汕头大学医学院硕士学位论文[结果]1.测序结果示：pOTB7-t