人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定论文

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1、人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定论文陈武，莫炜，张艳玲，宋钢，宋后燕【摘要】目的研究人纤溶酶原kringle区缺失突变体(PLGΔK)的毕赤酵母(Pichiapastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用7.5L发酵罐对工程菌PLGΔK/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测PLGΔK等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S2403分别测定PLGΔK激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果

2、7.5L高密度发酵可获得约为400mg/L培液的表达量，经三步纯化后制备的PLGΔK纯度大于96%。理化分析显示PLGΔK的等电点为7.5～7.8，分子量：27.787kD.freelg。结论初步建立了PLGΔK的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近，具备放大生产和应用的潜力。【关键词】毕赤酵母kringle区纤溶酶原缺失突变体纯化Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpression,purificationandcharactersofthekringledoma

3、indeletionmutantofhumanplasminogen(PLGΔK)inPichiapastoris.MethodsFermentationathighdensity(A600200)ina7.5Lfermentertheculturebrothinathreestepprocess:ultrafiltration,gelfiltration,ionexchangechromatography,andolecularidolyticactivityeasuredogenicpeptidesubstrateS24

4、03respectively.ResultsFermentationin7.5Lscaleyieldedanexpressionlevelofapproximately400mgPLGΔKperliterfermentationbroth.Throughthreestepsofpurification,thePLGΔKhadapurityofover96%.TheexactMSanditsIPediateproductionareparabletothatofplasminogenextractedfromhumanplasma

5、,indicatingagoodperspectiveinscaleupandapplication.Keyutant;kringledomain;Pichiapastoris;plasminogen;purification人纤溶酶原(plasminogen,PLG)是人体纤溶系统的主要成分，在体内经纤溶酶原激活剂(plasminogenactivator,PA)激活后，转变为纤溶酶(plasmin,PLM)，不仅发挥溶栓作用，还参与体内一系列与蛋白水解有关的生理病理过程，如炎症、组织修复、排卵、肿瘤侵袭和转移等。长期以来，纤

6、溶酶被认为是一种具有潜力的直接溶栓药物，但由于分子量大、结构复杂、富含糖链且易自身降解，采用大肠杆菌、哺乳动物细胞表达效率较低1,.freela公司;YNB、酵母提取物购自Difco公司;其余试剂均为国产分析纯;SephacrylS100HR、Superdex75、SPSepharoseFF(美国AmershamPharmacia公司);3kD、50kD超滤膜(MilliporePellicon);ProfluxM12超滤仪(Millipore);BIOFLO3000型7.5L发酵罐及C25kC型温控摇床(美国NBS公司)。

7、2方法2.1PLGΔK表达菌7.5L罐批发酵采用NBS7.5L发酵罐高密度发酵，发酵条件控制：温度29.5℃(PID模式)，pH5.1(PID模式)，溶氧(35.0±5.0)%(Agit模式)，搅拌300～700r/min(D.O.模式)。甘油补加：初始速率为0.6mL·L-1·h-1，2h内逐渐升高至9mL·L-1·h-1，此后维持此速率，待A600达到150左右，停止补加甘油。甲醇诱导：初始速率为1mL·L-1·h-1，8h内逐渐升高至12mL·L-1·h-1，以后维持此速度，并根据溶氧值和pH值的变化，调整补加甲醇

8、的速率，直至诱导20h。2.2PLGΔK的分离纯化发酵液以8000r/min,4℃离心30min，上清用截留分子量50kD超滤膜除去残留菌体及沉淀，再以截留分子量3kD超滤膜浓缩至原体积的1/10。将浓缩液进行Sephacryl100凝胶过滤层析(层析柱100c