人neuritin毕赤酵母表达系统构建及表达产物功能的研究

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1、摘要且盟L构建neuritin篚J毕赤酵母分泌表达系统，获取具有天然活性的Neurifin蛋白，并对其进行功能研究，为进一步探讨neuritin的功能及作用机制奠定基础。左洼!PcR扩增∞urninORF，将其克隆到穿梭质粒pPIC9KeP，转化DH5ct菌，经PcI蚜口测序鉴定；抽提测序正确的pPlC9Koneuritin重组穿梭载体，线性化后电激转化GSll5毕赤酵母菌，使用G418筛选出稳定表达的酵母重组子，经pCR及酵母基因组测序正确；用甲醇诱导酵母重组子分泌表达Neuritin蛋白，并优化诱导表达的条件；表达产物经SDS-PAGE鉴定后

2、，用镍离子亲和层析法从酵母培养上清中纯化目的蛋白，纯化后的蛋白再经Western-blot鉴定。最后，将纯化的Neuritin蛋白分别加入到PCI2细胞和鸡胚背根神经节的培养基中，对其生物学功能进行研究．绪墨．_1．构建Tneuritin基因片段的重组穿梭质粒．pPlC9K-neuritin，经PCR鉴定和序列分析证实，neuritin基因已正确插入穿梭质粒的多克隆位点。2．获得了neuritin毕赤酵母重组子，经PcR鉴定和序列分析证实，neuritin基因已正确重组入酵母基因组中。3．用甲醇诱导neuritin酵母重组子表达获取了Neurit

3、in重组蛋白，经SDS-PAGE分析，Neuritin重组蛋白以分泌的形式存在于酵母培养上清中，其分子量约为12KDa。最佳诱导表达时间是72h。4．用镍离子亲和层析法从酵母培养上清中纯化Neuritin重组蛋白。经SDs．PAGE分析显示，Neuritin蛋白得到了有效纯化，纯化后的Neurifin蛋白经Western-blot证实确为Neuritin。5．Neuritin重组蛋白的生物学功能研究结果表明从毕乔酵母中得到的Neurifin重组蛋白有较好的生物学活性：Neuritin既可促进PCI2细胞的突起生长，发生类神经元改变；又可促进鸡胚背

4、根神经节的神经纤维生长，延长其存活时间。缝j金!1．成功构建neurifin的毕赤酵母分泌表达系统，并从表达产物中纯化得到Neuritin蛋白。2．Neuritin酵母表达蛋白的功能研究结果显示；．Neuritin可促进PCI2细胞的突起生长，发生类神经元改变；．Neuritin可促进鸡胚背根神经节神经纤维的生长，延长其存活时间；表明№ufiti

5、l有良好的神经生物学功能。本研究为进一步探i寸neuritin的生物学功能和神经系统疾病的临床应用奠定了良好的基础．．关键词：Neuritin：毕赤酵母表达系统；Pc12细胞；鸡胚背根神经节论文类型：A

6、(基础研究)AbstractQ凼￡￡丝；ToconstructPichiapastorissecretarysystemofneuritin，andtoobtainNeuritinproteinandstudyitsfunction,whichwasthebasisofmakingafurtherresearchonfunctionandmechanismofneuritin．．M．．．．e．．．t．h．．．o．．d．．—s．：TheORFofneufitinwasamplifiedbyPCILandthenthefragmentwasinser

7、tedintoshuttleplasmidpPICgK，TheplasmidpPIC9K-neuritinWastransformedintoDH5u,positiveclonewasscreenedbyPCRandsequencing,andthenplasmidpPIC9k-neuritinWasextractedandtransformedintoPichiapastorisGSl15byelectrization,PichiapastorisrecombinantwithstableexpressionWasscreenedbyG418．

8、TherecombinantWasidentifiedbyPCRanalysisandsequencing，theninducedtherecombinanttoexpressNeuritinbymethan01．Theexpressionproductswe∞analyzedbySDS·PAGEand,atthesametime．selecttedtheoptimalexpressiontime．NeuHtinproteinWaspurifiedfromyeastculturesupernatantthroughnickelironaffini

9、tychromatography,andthepurifiedproteinWasidentifiedbyWestem-bloLFina