人deltalike1extfc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

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1、人Deltalike1extFc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达【摘要】目的:构建人Deltalike1extFc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIChDll1extFc,并在毕赤酵母GS115中表达。方法:以pEFBOSneohdll1extFc为模板PCR扩增人Deltalike1胞外段。通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIChDll1extFc。用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDSPAGE、illipore公司;小鼠抗人IgG1Fc抗体由第四军医大学免疫学教研室提供;羊抗小鼠IgG购自北京中杉

2、金桥公司;化学发光试剂盒购自Pierce公司。　　1.2方法　　1.2.1hdll1胞外段的PCR扩增　　根据PCR引物的设计原理,设计了能扩增出hdll1胞外段基因的一对引物。上游引物P1:5′端带有BamHI识别位点;下游引物P2:5′端带有EcoRI识别位点和剪接供体序列GGTAAGT,以利于插入的hdll1胞外段和Fc段基因在mRNA水平上的正确拼接。引物序列为P1:5′GGATCCGAACTGAAGCTGCAGGAGT3′;P2:5′GAATTCACTTACCTGGCCCGCCCTGGCCCTC3′。以pEFBOSneohdll1ex

3、tFc为模板,扩增hdll1胞外段基因片段。PCR扩增条件:95℃5min,95℃30s,60℃30s,72℃4min（45个循环）,72℃7min。扩增后,经10g/L琼脂糖凝胶电泳,回收PCR产物,克隆入pMD18T载体,得到pMD18Thdll1ext。　　1.2.2酵母表达载体PIChdll1extFc的构建　　先前我们构建了连接有人IgG1Fc的pET32aFc、PICFC载体。用EcoRI/BamHI从pMD18Thdll1ext载体中切下hdll1胞外段基因片段,亚克隆入pET32aFc,得到pET32ahdll1extF

4、c,再用EcoRⅤ和SacI从pET32ahdll1extFc切下hdll1extFC基因片段。插入EcoRⅤ切开的pPIC9k载体,连接、转化得到酵母表达载体PIChdll1extFc,用XbaI酶切鉴定连接方向,取方向正确的质粒进一步用EcoRI/BamHI酶切鉴定,初步鉴定为正确的质粒送测序。　　1.2.3毕赤酵母电转化及多拷贝重组菌的筛选　　按照Invitrogen公司提供的毕赤酵母操作手册制备毕赤酵母GS115感受态细胞。确定序列正确后,用SalI酶切线性化PIChdll1extFc,并以pPIC9k对照。电击转化到组氨酸缺陷型酵

5、母菌GS115中,取200μL转化液涂布于组氨酸缺陷的MD板上培养,待长出清晰的白色菌落。用灭菌去离子水将MD平板上长出的阳性菌落悬浮,按每平板1×105细胞涂于含G418不同浓度的YPD平板,其中G418浓度分别为0.25g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L,筛选获得高拷贝阳性菌株。　　1.2.4多拷贝His+Mut+克隆的筛选　　挑取50个在G418浓度为3.0g/L和4.0g/LYPD平板生长的His+Mut+克隆,分别点在MM、MD平板上30℃培养2d,MD板上生长速度明显快于MM板的克隆为His+Muts克隆

6、,其余为His+Mut+克隆。　　1.2.5重组蛋白的诱导表达　　挑选2个在4g/L、G418YPD上生长良好的His+Mut+克隆,分别接种于5mLBMGY,30℃、250～300r/min培养至A600达到2.0～6.0。1500g离心5min收集菌体,并重悬于BMMY培养液中,30℃进行摇瓶培养。分别于0、6、12、24、36、48、60、72、84、96h的时间点,取1mL培养基至1.5mL离心管,以确定诱导后收集细胞的最佳时间,每24h添加甲醇,使得甲醇终浓度保持5mL/L。　　1.2.6Ab),于4℃过夜;室温用PBST洗3次,加入辣根过氧化

7、物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗室温缓摇1h,用PBST洗3次,使用ECL试剂暗室显影、定影。　　2.2毕赤酵母表达载体PIChdll1extFc的构建　　将hdll1胞外段基因片段亚克隆入先前构建好的pET32aFc,得到pET32ahdll1extFc,再用EcoRⅤ和SacI从pET32ahdll1extFc切下hdll1extFC基因片段,插入EcoRⅤ切开的pPIC9k载体得到酵母表达载体PIChdll1extFc。用XbaI酶切鉴定连接方向,取方向正确的质粒进一步用EcoRI/BamHI酶切鉴定。经10g/L琼脂糖凝胶电泳可见

8、,XbaI酶切可得到预期3773bp、9927bp2