葡激酶在毕赤酵母中表达及纯化

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1、葡激酶在毕赤酵母中表达及纯化【摘要】目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因，克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中，重组载体线性化后，转化毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达。应用DEAE-SepharoseFF、Q-SepharoseFF和Sephacry1S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物，采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%；表达产物经DEAE-SepharoseFF、Q-SepharoseFF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%；测得其比活为5．2×

2、10�4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。�【关键词】葡激酶；毕赤酵母；表达和纯化ExpressionandpurificationofstaphylokinaseinPichiapastorisSONGLei，LIUHong-jun，LIUning.ShandongQuangangPharmaceuticalLimitedCompany,Jinan,250014�【Abstract】ObjectiveTostudytheexpressionstaphylokinasegeneinPichiapastorisandthepurific

3、ationofexpressionproduct.MethodsAn10artificialgeneforstaphylokinasewassynthesizedbyusingfavoredcodonsoftheyeastPichiapastoris.ThegenewasclonedintothesecretoryexpressionvectorpPIC9K,andtherecombinantvectorwaslinearizedandtransformedintoGS115,transformantshadexpressionafterinducementwithmethan

4、ol.TherecombinantproteinwaspurifiedthroughthestepsofDEAE-SepharoseFF、Q-SepharoseFF和Sephacry1S-200,andbioactivitywasanalyzed.ResultsTheexpressionofstaphylokinaseinPichiapastoriscameupto45%oftotalproteins;TherecombinantproteinwasfurtherpurifiedbyDEAE-SepharoseFF、Q-SepharoseFF和Sephacry1S-200tot

5、he95%purity;purifiedwasmorethan5．2×10�4AU/mg.ConclusionStaphylokinasehasbeenexpressedinPichiapastorisandpurifiedsuccessfully�【Keywords】Staphylokinase;Pichiapastoris；Expressionandpurification10葡激酶(SAK)是金黄色葡萄球菌产生的一种胞外激酶，能特异地激活血浆纤溶酶系统溶解血栓。在此作用过程中，血浆纤维蛋白原浓度几乎不受影响，加之分子量小，有较强地穿透性，对富含血小板地血栓，尤其是脑动脉血

6、栓和肢体静脉血栓地溶解较目前使用的链激酶和组织型纤溶酶原激活剂，具有溶栓速度快、毒副反应小和成本较低等特点，因而临床应用前景十分广阔[1-2]。目前，大肠杆菌表达的葡激酶已在国内上市，但存在产量低、不易纯化等问题。笔者使用的毕赤酵母是一种新型外源基因表达系统，具有许多明显优点，其诱导分泌表达的启动子AOX1可用甲醇严格调控，表达产物分泌到上清，不需要复杂的破菌手段。而且表达上清的杂蛋白含量很低，有利于进一步的分离纯化，是理想的表达系统[3]。1材料和方法1．1基因、菌种、载体葡激酶基因由大连宝生物合成；大肠杆菌DH5α为本单位保存；酵母穿梭表达载体pPIC9K，PichiaPa

7、storis表达菌GS115(His-mut+),购自Invitrogen公司。1．2酶及其他试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、G418低熔点琼脂糖为大连宝生物产品；柱层析填料DEAE-SepharoseFF、Q-SepharoseFF、S-200购自购自AmershamPharmacia公司；重组葡激酶活性测定国家标准品(1000IU/支)购自中国生物制品检定所；其他试剂均为分析纯。1．3培养基MD(13．4g/LYNB,4×1-4g/L生物素，2010g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉)；