罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化.pdf

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1、第26卷第1期2011年2月大连海洋大学学报JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYV01．26No．1Feb．201l文章编号：2095—1388《2011)Ol-0058—05罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化陈明1，王秋华1、2，王瑞1，黄婷1，梁万文1，李超1，雷爱莹1，陈福艳1，余晓丽1，甘西1(1．广西水产研究所，广西南宁530021；2．广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005)摘要：以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA，重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K／rtHsp70；在毕赤酵母Pich

2、iapastorisKM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70(rtHsp70)，对表达上清液进行SDS—PAGE及Westernblot分析；采用亲和层析、HiTrapDesahing预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明：克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致；诱导表达上清液经SDS—PAGE及Westernblot分析，上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致；每升诱导上清液可以获得约2mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70一肽疫苗研究奠定了基础。关键词：重组罗非鱼热休克蛋白70(rtHs

3、p70)；基因表达；毕赤酵母中图分类号：Q813．2文献标志码：A热休克蛋白Hsp70相对分子质量约70000，具有高度保守序列，在受到环境胁迫后能大量表达。因此，鱼类等水生生物Hsp70在各种应激条件下表达的变化是鱼类热休克蛋白被发现以来的研究热点。有学者曾提出，热休克蛋白可作为一种生物指标，通过检测水生生物Hsp70表达水平，对水环境进行监测。但是，Hsp70的表达水平并不总是与有害因素的作用强度平行，其机制较为复杂，监测水质时不能孤立考虑单项因素，因此利用HspTO作为水环境污染的监测指标有它的局限性¨屯1。研究表明，Hsp70作为分子伴侣与肿瘤细胞中的内源性多肽结合

4、，经细胞免疫途径发挥抗肿瘤效应，Hsp70与抗原肽结合的Hsp70一肽肿瘤疫苗具有很好的抗肿瘤作用，其可行性在实验动物上已得到证实[3。】。由于鱼类规模化养殖的发展，鱼类疾病越来越复杂，疫苗免疫将成为防治鱼类疾病的重要途径，但目前鱼类疫苗缺乏有效且使用方便的剂型，实际生产中难以广泛应用。因此，研制高效且使用方便的口服型和浸泡型鱼类疫苗已成为目前急需解决的问题。Hsp70抗原载体和免疫佐剂的特性为研究新型水产疫苗提供了理论基础，同时以Hsp70为鱼类疫苗免疫佐剂进行研究将填补国内外鱼类Hsp70在应用研究领域的空白。本研究中，作者利用毕赤酵母Pwhmpastoris大量制备重

5、组罗非鱼热休克蛋白70(rtHsp70)，旨在为以热休克蛋白作为免疫佐剂和肠道免疫增强剂用于罗非鱼链球菌病口服型疫苗的研究奠定基础。1材料与方法1．1材料质粒pMD—Hsp70为广西遗传育种与健康养殖重点实验室保存，表达载体pPIC9K及毕赤酵母菌株KM71购于Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、T4DNALigase购自TaKaRa公司；限制性内切酶AvrII、EcoRI、PmeI购自NEB公司；DNA回收试剂盒、质粒提取和纯化试剂盒、酵母基因组抽提试剂盒和蛋白相对分子质量标准购自天根生化科技有限公司；小鼠原性抗His—tag单克隆抗体购自Novagen公司；N

6、i—NTAagarose购自QIANGEN公司；HiTrapDesahing预装柱购自GE公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自威格拉斯公司；相对分子质收稿日期：2010一03-08基金项目：国家社会公益研究项目(2060302GXIF一2008—03)；国家科技支撑计划项目(2008BADB9804)作者简介：陈明(1979一)，男，助理研究员。E—mail：em990919@163．Corn通信作者：甘西(1956一)，男，研究员。E—mail：ganxien@126．tom第1期陈明，等：罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化59量为5000的超滤离心管购自Mill

7、ipore公司；引物由大连宝生物工程有限公司合成。1．2方法1．2．1引物设计及PCR扩增根据Hsp70编码核甘酸序列及分泌型真核表达载体pPIC9K多克隆位点序列，设计了1对引物。上游引物Hspf。5’CGGACCAATTCTCTDCAGCTAAAGGTGTAGCGATC3’，含EcoRI酶切点；下游引物Hspr，5’TAnTCCTAGGGTGATDGTGATGGTGATGGTCCACCTCCTCAATA∞’，含AvrII酶切位点，下游插入6个组氨酸标签。以质粒pMD—Hsp70为模板，扩增条件为：95℃下预变性