重组人抗pai抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究

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1、分类号：单位代码：10092密级：学号：20101026重组人抗PAI抑制作用的新型纤溶酶原激活单专剂突变体的表达与活性研究位：河北北方学院医学检验学院业：病原生物学研究生姓名：导师姓名及职称：研究起止日期：提交日期：李飞朱美财教授、贾天军教授2012．4．2013．42013．5河北北方学院一学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北北方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：豢羹靖研究生签名：弓妇2013年5月4日研究生学位论文独创性声

2、明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师签名：柴羹靖研究生躲罐够2013年5月4日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文重组人抗PAl抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯一”／日I

3、J舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯⋯⋯一材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一23附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·34结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38综述溶栓剂的研发现状及最新研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56中文摘要重组人抗PAl抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究摘要血栓性急性心脑血管病是严重威胁人类健康的疾病。目前在治疗这类疾病方面已经取得了重大进展，溶栓治疗是其中最为重要的技术之一。据世界卫生组织统计，全世界每年死于该类疾病的患者大约有1600万人，我国每年患有这类疾病的人数也有500万人。因此，研发出新的高效的溶栓药物受到越来越多研究机构的重视。组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivator，t-PA)是纤溶系统的生理性激活剂，由于t-PA与血栓基质纤维蛋白有很强的特异性亲和力

5、，能有效地在血栓局部激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。重组t-PA是利用基因工程技术开发出的用于治疗心脑血管病的特效药，与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身的纤维蛋白溶解、疗效高等优点，但是在临床应用中也有很多不足，如在体内可被肝细胞迅速清除，在血浆中存在纤溶酶原激活物抑制剂一1(P触．1)可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1--一5min)，使临床溶栓治疗时为维持有效浓度需大剂量(100一-150mg)，增加了系统性纤溶引起出血的危险。由德国的勃林格殷格翰(BoehringerIngelheim)制药公司生产的瑞替普酶(rt．PA)和

6、阿替普酶(CHO．t．PA)，已经成功投放市场用于治疗血栓性疾病。首先它们在体内的半衰期延长到了18min，且增强了与纤维蛋白的结合力，并且还是可逆结合，大大提高了激活纤溶酶原的活性。其次可通过静脉给药，且降低了用药剂量。但是它们的分子结构中有PAl．1的结合位点，血液中的PAI一1与其结合从而抑制纤溶活性。有国外文献报道血栓性疾病患者血中PAl一1浓度高于正常人，体外实验也证实了5U·mL以的PAI．1可以使5ng．mL～rt．PA和天然CHO．t．PA失活，所以临床用量仍较高。因此研制半衰期长且活性不受PAl．1抑制、用量小、成本低、副作用小的t-PA突变体

7、成为当务之急，本实验室在重组t-PA的基础上中文摘要使PAl．1位点的碱基突变，去除了指状区、表皮生长因子区和Kringle1区，使含有373．384PAl．1结合位点的rt．PA的基因序列AAGCACAGGAGG突变为GCGGCCGCGGCG，氨基酸KHRR相应变为AAAA，构建了新的t-PA突变体，并克隆于大肠杆菌表达载体。本研究构建pBV220．t．PA重组表达质粒，经DNA测序确认后，转化至大肠杆菌DH5a，温控诱导表达，凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化，复性后，过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化，酶动力学分析其活性。测序证实t-PA突变体的DNA序列正确，

8、表达蛋白占总菌体蛋白30