镰形扇头蜱抗凝血分子基因的克隆表达和产物活性分析

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1、新疆农业大学硕士学位论文镰形扇头蜱抗凝血分子基因的克隆表达和产物活性分析姓名：石磊申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：周金林;岳城20090501镰形扇头蜱抗凝血分子基因的克隆表达和产物活性分析摘要蜱是一类专性吸血的节肢动物，不仅是动物重要的外寄生虫，还是仅次于蚊子的人和动物疾病的第二传播媒介。与其它的吸血动物相比，蜱的吸血时间特别长，一般在10．14天才能达到饱血状态。在蜱吸血过程中，宿主会发生微血管收缩、血小板凝集和血液凝固等凝血反应。蜱通过唾液腺分泌抗凝血分子以克服宿主的凝血反应，达到成功吸血的目的。蜱源抗凝血分子的研究，不仅有助于了解蜱的吸血及病原传

2、播的复杂机制，开拓蜱及蜱传疾病新型防治技术。而且在开发人类心血管疾病的新型生物制剂上具有潜在价值。。镰形扇头蜱是我国南方优势蜱种，我们以吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消减杂交eDNA文库中的EST数据为基础，克隆出一个抗凝血分子编码基因C18。该基因全长580bp，编码164个氨基酸，预测分子量为18．04kDa(包括信号肽)。该蛋白分子在5’端有一个18个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的抗凝血Kunitz功能域。经同源性比较该基因与组织通道抑制因子同源。用RT-PCR方法分析了C18在镰形扇头蜱吸血前后的表达情况，结果表明C18为蜱吸血后诱导表达。成功构建了重组

3、表达载体pGEX．-4T-1．C18，并转化到表达菌Bkl中，经IPTG诱导，结果表明C18可以在原核表达系统中高效表达，应用GST融合蛋白纯化系统，可获得纯化的目的蛋白。通过血浆复钙时间试验和血浆部分凝血酶激活时间试验对重组蛋白的抗凝血活性经行检测，发现重组蛋白同时对内源性和外源性的凝血具有明显抑制作用。同时以镰形扇头蜱吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消减杂交eDNA文库中的EST数据为基础，应用RACE方法从镰形扇头蜱体内克隆出另一个抗凝血基因C201的全长序列，该基因全长693bp，开放阅读框编码195个氨基酸，预测分子量为22．62kDa，该蛋白分子在5’端有一个2

4、0个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的抗凝血Kunitz．BPTI功能域。经同源性比较该基因与组织通道抑制因子II基因序列高度同源。综上所述，本研究首次克隆了镰形扇头蜱C201抗凝血蛋白基因，为该基因的进一步研究打下了基础。首次克隆并表达了镰形扇头蜱C18抗凝血分子，分析它的表达特点，并对其抗凝活性进行了初步研究，为蜱抗凝血基因的进一步研究打下了良好基础。关键词：镰形扇头蜱；C18基因：C201基因；克隆表达；活性分析CloningandExpressionofGeneEncodingtheAnticoagulantProteinofRhipicephalus

5、haemaphysaloidesTickandtheActivityAnalysisofItsExpressedProductsAbstractTickisaspecialcategoryoftheblood—suckingarthropo&，notonlyallimportantforeignanimalparasites，butthesecondmediaofmosquitoandanimaldiseases．Comparedtootherblood—suckinganimals，ticksspendmoretimetovampire,usuallyneed10

6、-14daystoreachastateoffullblood．Oftheblood-sucking，thehostproducedcoagulationreaction，suchasmierovascularreaction、plateletaggregationandbloodcoagulation．Ticksalivaryglandsecretiontheanticoagulanttoovercomethehostcoagulationresponseforvampirringsuccessful．ResearchingofTickanticoagulantp

7、rotein，notonlyhelpstounderstandtheblood—suckingprincipleandthespreadofpathogenicmechanisms，butopenuptickandtick-bornediseasepreventionandcontrolofnewtechnology．Inaddition,tickanticoagulantpeptidehavegreatvaluefordevelopingtheantithromboticdrugs．Rhipicephalushaemaphysaloidesistheedges