哈维弧菌vh-taa的基因克隆表达分析和粘附活性研究

《哈维弧菌vh-taa的基因克隆表达分析和粘附活性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码：10264研究生学号：M090104209上海海洋大学硕士学位论文哈维弧菌Vh-TAA的基因克隆表达分析和粘题目：附活性研究Vh-TAAGeneCloning,Expression英文题目：AnalysisandAdhesionActiveResearchinVibrioharveyi专业：临床兽医研究方向：渔业生物病害姓名：刘金叶指导教师：冯娟副研究员上海海洋大学，上海，200090中国水产科学院南海水产研究所，广州，510300上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈

2、交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可

3、以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文哈维弧菌Vh-TAA的基因克隆表达分析和粘附活性研究摘要哈维弧菌（Vibrioharveyi）属于革兰氏阴性菌，广泛存在于海水环境中，是海水养殖动物的一种常见致病菌，可引起多种海水养殖动物发病，且死亡率高、影响范围广，给水产养殖业造成了极大的经济损失。病原菌的致病过程中粘附是引发宿主感染的第一步，而粘附素作为病原菌一个重要毒力因子在细菌

4、的粘附过程中起着重要的作用。随着对病原菌致病机理研究的不断深入，人们在革兰阴性菌中发现了一类新的粘附素—三聚体自转运粘附素（TrimericAutotransporterAdhesions，TAA），这类广泛存在于变形菌门，它们在氨基序列和序列大小上存在高度的差异，但是确具有相似的结构特征：即包含N末端信号肽、中间的承载结构域和C末端的转运单位，其中他们的C末端的转运单位在所有的TAA中是同源的，并成为定义TAA的一个标志性区域。TAA作为革兰氏阴性菌与宿主细胞相互作用的重要毒力因子，已成为当前研究病原菌致病机制的热点

5、。目前在哈维弧菌中还未见有关TAA的报道，我们通过同源比对后采用基因步移的方法成功获得了哈维弧菌的一个636bp的开放阅读框（ORF），该ORF编码212个氨基酸，经SMART软件分析发现该氨基序列具有显著的TAA的结构特征，采用信号肽序列分析软件分析发现该氨基序列包含一个1-22aa的信号肽序列，对其预测的同源的C末端的转运区域进行二级机构比对分析，发现它们都包含4个β折叠和一个与其相连的Coiledcoil片段，最后经daTAA验证分析，证实获得的序列为哈维弧菌的一个三聚体自转运黏附素Vh-TAA。为了研究该蛋白的

6、生物学功能，通过分析对预测的承载结构区域进行了原核表达，因为承载结构区域是TAA的功能区域。我们成功构建了重组表达质粒pRSETA-vhp，将该质粒转入表达菌株BL21(DE3)plysS，经IPTG28°C诱导表达，SDS-PAGE蛋白电泳分析，获得了一个22KDa可溶性重组蛋白，经WesternBlot检验，证实获得的重组蛋白为我们所需蛋白。采用Ni-琼脂糖凝胶纯化获得了重组蛋白，并免疫小鼠，成功制备了重组蛋白的多克隆抗体，间接ELISA测定抗体效价为1:16000。最后应用免疫荧光双标记技术，对重组蛋白进行粘附活

7、性实验，激I上海海洋大学硕士学位论文光共聚焦扫描电镜观察，结果显示重组蛋白可以粘附于鲤鱼上皮细胞；重组蛋白及其抗体的粘附抑制试验分别可以显著抑制哈维弧菌对鲤鱼上皮细胞的粘附作用。最终得出哈维弧菌的Vh-TAA具有细胞粘附活性。为进一步研究环境因子对哈维弧菌vh-taa基因表达的影响，利用哈维弧菌vh-taa基因设计了一对特异性引物，扩增产物为194bp的片段，以16srDNA的片段作为内参，利用荧光定量PCR来检测了温度、盐度和铁离子浓度变化对vh-taa基因表达的影响。采用双标准曲线相对定量法对获得的数据进行处理分析

8、，结果发现温度变化对vh-taa基因的表达量影响差异不显著（P﹥0.05）；盐度的影响差异显著(P﹤0.05)，在Nacl浓度为40‰时vh-taa表达量最高；铁离子浓度的影响差异显著(P﹤0.05)，在铁离子浓度为1umol/L时vh-taa表达量最高。为快速的诊断哈维弧菌，采用环介导等温扩增技术（LAMP）成功构建了一种哈维弧