哈维弧菌T6SS中rbsB、vgrG、hcp基因的表达及功能分析.pdf

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150150295上海海洋大学硕士学位论文哈维弧菌T6SS中rbsB、vgrG、hcp基因的题目：表达及功能分析RbsB,vgrG,hcpgeneoftypeVIsecretion英文题目：system(T6SS)inVibrioharveyi:Expressionandfunctionalanalysis专业：渔业研究方向：水生生物病害姓名：贝蕾指导教师：冯娟二O一八年四月上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明:我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得

2、的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:日期:年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导

3、教师签名:日期:年月日日期:年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注林蠡仲恺农业工程学院教授答辩主席广东省水生动物疫病马亚洲高级工程师答辩委员预防控制中心陈偿中国科学院南海海洋研究所研究员答辩委员中国水产科学研究院冯娟研究员答辩委员南海水产研究所中国水产科学研究院郭志勋研究员答辩委员南海水产研究所中国水产科学研究院邓益琴助理研究员答辩秘书南海水产研究所答辩地点欣海楼7楼学术报告厅答辩日期2018.5.27上海海洋大学硕士学位论文哈维弧菌T6SS中rbsB、vgrG、hcp基因的表达及功能分析摘要哈维弧菌（Vibrioharveyi）作为海

4、水养殖业重要的致病菌，可感染多种鱼、虾、蟹等并造成大量的死亡，在水产养殖中受到高度重视。Ⅵ型分泌系统(T6SS)主要存在于革兰氏阴性细菌中，具有增强生物膜形成的特性及识别非己的功能，并参与了细菌间的相互作用，表现出复杂多样的生物学功能。为了研究哈维弧菌的T6SS，本研究选择T6SS中针尖状结构的缬氨酸-甘氨酸重复蛋白（VgrG）、T6SS负责运输效应因子并作为分子伴侣的溶血素协同调节蛋白（Hcp）、依靠T6SS分泌的核糖体结合蛋白（RbsB）作为主要研究对象，分析其序列特征及其进化关系，制备原核表达重组蛋白及其多克隆抗体，建立qPCR技术；利用已建立的qPCR技术研究不同培养条件对三者表达

5、的影响；最后通过敲除vgrG、rbsB、hcp及其相关的基因，研究三者同其调控基因在T6SS，以及T6SS在整个细菌致病机制中发挥的作用。主要结果如下：1、rbsB、vgrG、hcp基因分别包含879bp、1836bp、480bpDNA序列长度，可分别编码292aa、611aa、159aa。RbsB蛋白为可分泌的周质蛋白，在运载结合中发挥作用；VgrG蛋白与T4噬菌体gp27/gp5组件同源，帮助细菌锚定宿主细胞分泌效应因子；Hcp蛋白与T4噬菌体gp19/gp5同源，可形成六聚体通道，以供小分子蛋白分泌及自身转I上海海洋大学硕士学位论文运。从rbsB、hcp到vgrG基因，三者的属间变异

6、率逐渐升高，在哈维弧菌类的相似率分别为97-100%、99-100%和70-99%，在弧菌属内的相似率分别在90%、84%和40%以上，这同它们的生物学功能特点一致。2、研究了哈维弧菌菌株354在不同培养条件（温度、盐度、pH、铜离子、铁离子）下培养4、8、12、24、48h后rbsB、vgrG、hcpmRNA表达情况。结果发现：rbsBmRNA，在28℃、1%NaCl、pH7.5、无Fe3+、无Cu2+培养条件下，随时间呈凹型表达模式，即在生长对数期为典型洼地。仅提高培养温度，其中后期表达量明显提高；改变盐度，在早期呈现高盐诱导效应；调节pH，则无论偏酸或者偏碱，俱提高其中后期表达；添加

7、Fe3+，可见高浓度Fe3+抑制早期的rbsB表达；添加Cu2+，则无明显诱导效应。vgrGmRNA，在高温培养条件下，其表达受到抑制；低渗（0.5%）明显诱导基因在整个培养过程中的高表达，高渗影响不显著，都呈凹表达模式；在偏酸或偏碱条件下，早期对于其表达无影响，中后期诱导表达量的上升；对于添加Fe3+实验组而言，高浓度铁离子显著诱导vgrG高表达；适当浓度的铜离子（1mM、2mM）可刺激vgrG的表达，在培养中后期其表