基因表达及功能分析基本策略

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1、第二十六章基因表达及功能分析的基本策略STRATEGIESFORANALYZINGGENEEXPRESSIONANDFUNCTION第一节基因表达的分析策略StrategiesforAnalyzingGeneExpression一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。开放性系统研究方法:如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可

2、以发现和分析未知的基因。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。（一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平1．Northern印迹（Northernblot）既可分析mRNA表达又可验证cDNA新序列是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术Northern印迹分析原理示意图2．核糖核酸酶保护实验（ribonucleaseprotectionassay，RPA）可用于mRNA定量和RNA剪接分析是一种基于杂交原理分析mRNA的方法，既可对mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏度和特异性都很高。核糖核酸酶保护实验原理示意图可

3、对mRNA进行区域定位是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充。通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。3．原位杂交（insituhybridization，ISH）（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法1．反转录

4、PCR可用于mRNA的半定量分析反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。常用于mRNA的定量分析实时定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)

5、是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。2．实时定量PCR目前有5种技术用于实时定量PCR：其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBRGreen）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加；其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法，它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，但是成本较高。S

6、YBRGreen实时定量PCR分析原理示意图二、通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征Western印迹（Westernblot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码多肽蛋白质样品的制备SDS-PAGE分离蛋白质转膜特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交再经

7、偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息Westernblot基本程序酶联免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同——顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专

8、门的酶标仪测定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析与Western印迹原理相似但形