脆皮大头蛙Cathelicidins基因克隆、表达及结构与功能分析

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1、硕士学位论文脆皮大头蛙Cathelicidins基因克隆、表达及结’构与功能分析GeneCloning、Expression&StructureandFunctionalCharacterizationofCathelicidinsfromLimnonectesfragilis作者姓j名：学科、专业：学号：指导教师：王渔室副塾援完成日期：圣Q!圣生墨旦大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导

2、下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。学位论文题目：喻盘趔燧厶也区笾缸迭圜互唐磊选隆缅斡妄盗酝历厕作者签名：：j猩逝日期：丝』墨年名月尘、大连理工大学硕士学位论文摘要Cathdiddins是一类由N端信号肽区域、中间保守eathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域组成的宿主防御肽家族，是脊椎

3、动物自然免疫的关键因子，发挥着重要的抗微生物感染和病原体入侵效应，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。迄今为止，在自然界几乎所有脊椎动物，包括哺乳类、鸟类、爬行类和低等的鱼类中均有发现，唯独在两栖类中几乎没有报道。在本论文中，我们首次报道了来源于两栖类蛙科物种—脆皮大头娃(Limnonectes肛硒凰)的eathelicidin基因。从所构建的脆皮大头蛙皮肤eDNA文库中，首次克隆得到了两条编码cathelieidins前体的eDNA核酸序列。序列全长分别为586bp和596bp，由此推断出的两条c

4、athelicidin前体分别由155和151个氨基酸残基组成。Blast比对分析，其结构同样包括N端信号肽区、中间保守的eathelin区和C端成熟肽区三部分。进化分析表明，两栖类蛙科cathelieidins与爬行类(蛇)、鸟类(鸡、鹌鹑、环颈雉)来源的eathelieidins在系统进化树中独立成簇，与这些物种的进化先后顺序相吻合，这为eathelieidin基因家族的起源以及结构多样性和功能分化的进化机制研究，提供了非常有效的补充证据。对于不同物种而言，cathelicidin前体的酶切位

5、点不尽相同，而经蛋白酶作用后释放出来的成熟肽序列更是千差万另IJ。比对后，根据eathelin区域中弹性蛋白酶(哺乳动物eathelieidin家族常见酶切位点，．Val．)和胰蛋白酶酶切位点(蛙类抗茵肽家族常见酶切位点，．Lys-Arg-或．姆Arg．)分别对这两条前体肽中成熟肽的序列进行了预测，所推断的四条成熟肽分别命名为Lf-CATHl／2与LfCATHl以a。化学合成Lf-CATHl／2成熟肽，进行抗菌活性检测，发现其对40种测试菌株均没有抑菌活性。而经大肠杆菌原核表达的Lf-CATHla

6、成熟肽，药敏实验显示对金黄色葡萄球菌有抑菌圈。合成的Lf：CATHla对所测试的金黄色葡萄球菌ATCC25923、IS090223、ISl307、和大肠杆菌ATCC25922表现出较强的抗菌活性，且Lf-CATHla溶血活性和凝集素活性均不明显。以上结果说明依据胰蛋白酶酶切位点释放成熟肽的可能性较大。除此以外，LfCATHla还具有较强的抗氧化性，对DPPH自由基的清除率为57．79％。鉴于两栖类复杂的生存环境，以上结果表明Lf-CATHla在宿主复杂的免疫机制中不仅起到抗微生物感染作用，而且还可

7、能发挥了其他重要功能，如抗氧化以保护两栖类裸露的皮肤等。关键诃：脆皮大头蛙；Cathelicidins；酶切位点；原核表达；结构与功能脆皮大头蛙Cathelicidins基因克隆、表达及结构与功能分析GeneCloning，Expression＆S仃uctl】reandFunctionalCharacterizationofCathelicidinsfromLimnonectesfragilisAbstractCathelicidins，onefamilyofhostdefensepeptides

8、,arecharacterizedbyallN-terminalsignalpeptide，andaconservedcathelindomainfollowedbyahighlydivergentC-terminalmaturepeptide．Thefamileofcathelieidinsisthebridgetoconnectthenaturalandspecificinllnunesystem，whichse-1"veacriticalroleinvertebrateinn