甜瓜α-甘露糖苷酶基因的克隆、表达特性及功能分析

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1、内蒙古大学博士学位论文学校代码：10126分类号G78UDC577论文题目学号：92100807编号甜瓜a—甘露糖苷酶基因的克隆、表达特性及功能分析所在学院：专业：研究方向：研究生：指导教师：2014年05月25日一塑凰一墅堕生一基一萤一蛀堂王盈鲢■堂金兰鹕一堇整盏塑牲直盒堂生一型盟生一丝王畦堑一塑垃彗监原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进{亍的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得出塞查盍堂及其他教育机构的学位或证

2、书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：必!垫璺必丝幽指导教师签名：瞳塑础荔日期：删．f．戈f日期：动·烨。，、三歹在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大

3、学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用}二发表论：文=，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。学位论文作者签名：笺熟墅查堡堡勘鱼掣指导教师签名j飙丝塑：主：堑日期甜瓜Q一甘露糖苷酶基因克隆、表达特性及功能分析摘要甜瓜是具有重要商业价值的园艺作物，对于消费者来说，它的品质是一个重要的质量属性。甜瓜果实中含有香味挥发物、可溶性糖、有机酸、色素、次生代谢物等，可以提供很多人类的日常饮食营养，因此受到人们的喜爱。甜瓜果实不耐贮运，货架期相对较短，在运输和销售

4、过程中伴随着果实的成熟和软化，损失加剧。而且，采摘后果实过度软化引起皱缩、干燥和霉变，严重降低了甜瓜果实的质量和感观性状。0【一甘露糖苷酶(O【一mannosidase)是一类关键性糖苷酶，由很多成员组成。它的功能是修剪糖蛋白糖链中的不同甘露糖基，它不仅在糖蛋白的形成过程中发挥重要作用，并且参与果实的成熟与软化。为了研究甜瓜仅一甘露糖苷酶基因(仅．Man)在果实发育成熟中的功能，本论文以甜瓜品种河套蜜瓜为研究材料，克隆了甜瓜果实中的19c．Man基因全长cDNA。测定了甜瓜根、茎、叶、子房等不同组织和不同发育时期

5、的果实中仅一甘露糖苷酶活性，结果表明在子房中的酶活性最低，根、茎、叶组织中的酶活性较高，约为子房中活性的3～5倍。授粉后10"～30d的果实中，其活性显著下降，而授粉后40d果实果皮颜色变黄，其活性有所增加。RT-qPCR分析结果显示，仅一Man基因在叶片中的表达量最高，子房中表达量最低，叶片中表达量约为子房中的表达量的6倍，授粉后lO'～30d仅．Man基因表达量显著下降，而授基金项目：国家自然科学基金资助项目(31101559)甜瓜a-甘露糖苷酶基因的克隆、表达特性及功能分析粉后40d果皮颜色变黄，其表达量有

6、所回升。利用农杆菌介导的瞬时表达技术，分别将含仅一Man基因的超表达载体pPZP221一Man、RNAi载体pART-Manl和pART-Man2的农杆菌菌液注射至成熟期甜瓜果实，进行瞬时表达，并对其进行了表达特性分析。3～5天时，注射超表达载体菌液的果实在注射部位出现了提前变黄的表型。5～7天时，注射RNAi载体菌液的果实在注射部位仍保持绿色(推迟变黄)。a．甘露糖苷酶活性测定结果显示，与非注射部位相比，注射超表达载体的组织0【．甘露糖苷酶活性较高，而注射RNAi载体的组织仅．甘露糖苷酶活性较低。RT-qPCR

7、分析表明，在瞬时超表达仅一Man基因的果实组织中，仅一Man基因和ACS6等成熟相关基因表达水平增高，而在瞬时抑制仅一Man基因表达的果实组织中，这些基因表达水平有所下降，表明仅．Man基因具有促进果实成熟的功能。应用花粉管通道法转化技术，分别将pPZP221一Man(Oe-Man)和pART-Manl(Ri—Man)载体导入甜瓜，经PCR检测证明外源基因已经整合到受体植物的基因组中，分别获得了T1代和T2代转基因植株。与未转基因对照甜瓜相比，转Oe．ManTl代甜瓜果实提前10d成熟，6c—Man基因及成熟相关

8、基因表达量显著提高，0【一甘露糖苷酶活性也显著升高；转尺i．ManlT2代甜瓜果实成熟期和采后贮藏期显著延长，仅一Man基因和成熟相关基因表达量以及0【一甘露糖苷酶活性下降。结果表明，甜瓜0c—Man基因在甜瓜果实耐贮藏基因工程中具有重要应用价值。关键词：甜瓜(Cucumismelo)；仅．甘露糖苷酶基因；农杆菌；瞬时表达；功能内蒙古大学博士学位论文CLONING,EXP