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时间:2019-03-01
《草鱼(ctenopharyngodon idella)hsp90、wap65基因的克隆、表达特性及功能分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、南昌大学硕士学位论文草鱼(Ctenopharyngodonidella)Hsp90、Wap65基因的克隆、表达特性及功能分析姓名:赵凤云申请学位级别:硕士专业:水生生物学指导教师:胡成钰20110608摘要草鱼(Ctenopharyngodonidellus)Hsp90(CiHsp90,GU258544)克隆于草鱼肝肾eDNA文库。CiHsp90全长为2793bp。CiHsp90有广谱的本底组织表达,经34。C短暂诱导后,其表达水平有一定的上调。为了解CiHsp90的功能,一方面,克隆了ATPase结构域eDNA与载体连接后转化大肠杆菌进行4℃冷、42"12热激保护实验。
2、另一方面,原核表达、纯化获得该目的多肽P朋Pasc,将n册敬进行柠檬酸合成酶凝集实验。CiHsp90除了对大肠杆菌有冷,热保护作用外,在高温状态时能够降低柠檬酸合成酶的凝集程度。Wap65是机体参与温度调节和免疫应答反应的一种应激蛋白,它在鱼类适应变温生活等方面起重要作用。本文在经PolyI:C诱导的草鱼肝肾eDNA文库中筛选并克隆了1个Wap65(HM629798)。草鱼Wap65全长eDNA为1510bp。进化树显示,草鱼Wap65与斑点叉尾鲴Wap65-2进化关系最近。定量PCR研究草鱼Wap65的表达特征,结果表明:Wap65在肝中有较强的本底表达,而在脾、肾、脑
3、和肠等组织中该基因表达非常微弱。34"C热激2h后,在脾脏中,Wap65的表达量有一定的上调;在肝脏中该基因的相对表达量大量增加,而在其他受检组织中Wap65的表达无明显变化。PolyI:C诱导以后,在脾脏中,Wap65的表达量有一定的上调;在其他受检组织中无明显变化。LPS诱导以后,在受检组织中的表达量都下调。因此,草鱼Wap65主要在肝脏中表达。本研究克隆的草鱼Wap65可能是Wap65-2。关键词:Hsp90;ATPase结构域;Wap65;应激蛋白AbstraetAbstractThegrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)Hsp90g
4、enewasclonedfrommixedliverandkidneycDNAlibrary(CiHsp90,GU258544).ThefulllengthsequenceofwhichWas2793bp,containeda5'untranslatedregionof104bpanda3'untranslatedregionof292bp.Theopenreadingframewas2397bpwhichcouldcodea798aminoacidspeptide.Analysisofthededucedaminoacidsequenceindicatedthatthe
5、maturepeptidepossessedanATPasedomain(96-255aa).TheRT-PCRanalysisshowedthatCiHsp90wasubiquitouslyexpressedatlowerlevelsinalldetectedtissuesandup—regulatedafterheatshockat34℃.TounderstandthefunctiontheATPasedomainofCiHsp90involvinginthermalprotection,anexpressionvectorcontainingitseDNAwasex
6、pressedinE.coliBL21(DE3)plysS.Upontransferfrom37℃to42℃,thesecellsthataccumulatedPATPase(recombinantpeptideoftheATPasedomain)displayedgreaterthermoresistancethancontrolcells.Whileincubatedat4℃fordifferentperiods,itcouldalsoimproveviabilitycomparedwitllcontrolcultures.Theresultsshowedthatth
7、eATPasedomainofCiHsp90couldcontributetoprotectingcellsagainstboththermalextremes.Moreover,weexpressedandpurifiedthepeptideofPATPaseusingforthecitratesynthaseaggregationassays.ItsuggestedthattheATPasedomainofCiHsp90couldreducethelevelofcitratesynthaseaggregationatthe
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