草鱼(ctenopharyngodon idella)hsp90、wap65基因的克隆、表达特性及功能分析

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1、南昌大学硕士学位论文草鱼（Ctenopharyngodonidella)Hsp90、Wap65基因的克隆、表达特性及功能分析姓名：赵凤云申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：胡成钰20110608摘要草鱼(Ctenopharyngodonidellus)Hsp90(CiHsp90，GU258544)克隆于草鱼肝肾eDNA文库。CiHsp90全长为2793bp。CiHsp90有广谱的本底组织表达，经34。C短暂诱导后，其表达水平有一定的上调。为了解CiHsp90的功能，一方面，克隆了ATPase结构域eDNA与载体连接后转化大肠杆菌进行4℃冷、42"12热激保护实验。

2、另一方面，原核表达、纯化获得该目的多肽P朋Pasc，将n册敬进行柠檬酸合成酶凝集实验。CiHsp90除了对大肠杆菌有冷，热保护作用外，在高温状态时能够降低柠檬酸合成酶的凝集程度。Wap65是机体参与温度调节和免疫应答反应的一种应激蛋白，它在鱼类适应变温生活等方面起重要作用。本文在经PolyI：C诱导的草鱼肝肾eDNA文库中筛选并克隆了1个Wap65(HM629798)。草鱼Wap65全长eDNA为1510bp。进化树显示，草鱼Wap65与斑点叉尾鲴Wap65-2进化关系最近。定量PCR研究草鱼Wap65的表达特征，结果表明：Wap65在肝中有较强的本底表达，而在脾、肾、脑

3、和肠等组织中该基因表达非常微弱。34"C热激2h后，在脾脏中，Wap65的表达量有一定的上调；在肝脏中该基因的相对表达量大量增加，而在其他受检组织中Wap65的表达无明显变化。PolyI：C诱导以后，在脾脏中，Wap65的表达量有一定的上调；在其他受检组织中无明显变化。LPS诱导以后，在受检组织中的表达量都下调。因此，草鱼Wap65主要在肝脏中表达。本研究克隆的草鱼Wap65可能是Wap65-2。关键词：Hsp90；ATPase结构域；Wap65；应激蛋白AbstraetAbstractThegrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)Hsp90g

4、enewasclonedfrommixedliverandkidneycDNAlibrary(CiHsp90，GU258544)．ThefulllengthsequenceofwhichWas2793bp，containeda5'untranslatedregionof104bpanda3'untranslatedregionof292bp．Theopenreadingframewas2397bpwhichcouldcodea798aminoacidspeptide．Analysisofthededucedaminoacidsequenceindicatedthatthe

5、maturepeptidepossessedanATPasedomain(96-255aa)．TheRT-PCRanalysisshowedthatCiHsp90wasubiquitouslyexpressedatlowerlevelsinalldetectedtissuesandup—regulatedafterheatshockat34℃．TounderstandthefunctiontheATPasedomainofCiHsp90involvinginthermalprotection，anexpressionvectorcontainingitseDNAwasex

6、pressedinE．coliBL21(DE3)plysS．Upontransferfrom37℃to42℃，thesecellsthataccumulatedPATPase(recombinantpeptideoftheATPasedomain)displayedgreaterthermoresistancethancontrolcells．Whileincubatedat4℃fordifferentperiods，itcouldalsoimproveviabilitycomparedwitllcontrolcultures．Theresultsshowedthatth

7、eATPasedomainofCiHsp90couldcontributetoprotectingcellsagainstboththermalextremes．Moreover,weexpressedandpurifiedthepeptideofPATPaseusingforthecitratesynthaseaggregationassays．ItsuggestedthattheATPasedomainofCiHsp90couldreducethelevelofcitratesynthaseaggregationatthe