甜瓜skip同源基因的克隆及表达特性分析

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1、甜瓜同源基因的克隆及表达特性分析摘要：干旱、寒冷、盐碱等非生物逆境是制约着植物生长的主要因素，在目前生态环境日益恶化的状况下，提高植物的抗逆性有关研究无疑具有重大意义Uj。运用基因工程手段来提高植物的抗逆性则比传统育种方式更有优势［2］。目前研究表明，SKIP基因作为一种植物抗旱相关转录因子，在逆境胁迫中呈现表达量的明显增加。本实验应用RT-PCR技术克隆得到甜瓜S/C/P同源基因。利用Real-timePCR技术检测基因对甜瓜根、茎、叶不同组织屮的表达情况进行初步鉴定。关键词：甜瓜SKIP同源基因克隆Real-TimePCR1绪论1.1SKIP基因及其蛋白功能

2、1.1.1SKIP蛋白的结构特点几乎在所有的真核生物基因组中都存在编码SA7P(Ski-interactingprotein)的基因，从低等真核生物到高等的动、植物中都有拷贝。SKIP蛋白大小约60-80KDa,一般情况下定位于细胞核中从氨基酸序列的一级结构比较可以发现，SKIP蛋白的基本结构中含有多个其它蛋白所不具有的高度保守的结构。并且这些保守的区域几乎都是SKIP所特有的，即在其它的蛋白质屮没有发现它们的同源序列,其中SNWKN是最典型的高度保守的基序。某些物种的SKIP蛋白还奋一些显著的磷酸化位点。预测的二级结构显示，在第299位氨基酸到第360位氨基酸

3、之间存在一个a螺旋，其等电点很高，是很多互作蛋白结合的部位［41。而且它的其他部分也可以和不同蛋白质相结合，因此SKIP能够与多种类型的蛋白质发生互作［3］。此外，SKIP蛋白的有些部分还存在一种部分折叠的状态，以便于它在和不同蛋白互作后发生可以完成再次折叠W，这样的结构特点使它具有超强的与蛋白发生互作的能力(Alonsoetal.,2002)oSKIP家族进化树比较中，除酵母中的PRp45外大多数蛋白都具有相同的序列特征。这个蛋白不仅缺失N端部分，余下的区域特征与其它蛋白的相似性也较低。1.1.2SKIP的功能及研究现状SKIP蛋白的功能可以概括为两大类，一个

4、是作为RNA剪切复合体的组成部分参与前体mRNA的剪切、转录延伸及成熟mRNA的运输［3］;另一个则是根据其结合的蛋白的不同，在与其它转录因子结合形成转录调控复合体的表达屮，进行共调节与共抑制的转换角色W。自20世纪80年代，SKIP同源蛋白在果蝇中被首次鉴定并命名为Bx42以来,在其他物种中的研宄随即展开1998年，人类的SKIP被证明参与了剪接复合体，随后酿酒酵母的PRP45也被认为是完成mRNA的剪接过程中不可或缺的辅助因子［8］。并且，酿酒酵母PRP45蛋白也被报道含有SNW/SKIP结构域，并在保持细胞活性中发挥重要功能。虽然SKIP蛋白家族成员本身具

5、奋极苏保守的结构和序列，但不同种类生物中的SKIP蛋白具有其完全不同的结合蛋白，这也表明该蛋白在基本功能上进化和衍生出来的新功能在不同物种中都各不相同f91。根据对水稻、拟南芥等模式植物的研允过程显示，植物除了通过表达特定基因提高植物耐受性以外，RNA剪接的调控也是一种植物抵抗外界非生物逆境胁迫的方式L1Qj。对拟南芥SKIP同源基因AtSKIP基因研究表明，SKIP是mRNA剪接的转录因子，在前体mRNA剪接作用中通过直接与前体mRNA结合发挥左右，而且AtSKIP蛋白既是一个积极的调节因子也是潸在的转录因子，在非生物逆境胁迫的信号转导通路中也起到一定的作用。

6、在对于水稻抗逆基因OsSKIPa研宂中发现，OsSKIPa能够调整细胞活力及抗逆性。转基因水稻屮OsSKIPa的表达极人地提高了植株在逆境中的生长阶段的抗旱能力，增加清除活性氧的能力和提高干旱胁迫下于逆境相关基因的转录水平［3］。2012年张彦威从大豆中克隆得到一个编码SKIP的基因，命名为GmGBPl，在PEG6000干旱胁迫处理大豆叶片中发现，叶片中GmGBP/基因呈正调控应答，且在4h时达到高峰［11］。王小敏等人通过对玉米SKIP同源基因克隆得到ZmSKIP基因，并对玉米屮ZmSKIP氨基酸序列进行分析发现，ZmSKIP也具奋一个特定核定位信号肽，这与已

7、报道的SKIP蛋白都是核定位蛋白相一致［12］。转录因子蛋白主要通过与目的基因启动子中特定元件的结合来调控下游基因的表达，发挥其生物功能，而SKIP是真核生物中的转录共激活子，在转录和剪接屮发挥保守的共激活的作用。并且SKIP通过与不同蛋白互作，更突显其在mRNA生成的不同阶段的多个环节中的功能。冋吋，S/C/P还作为重要的转录因子调节植物抵抗逆境胁迫的能力。1.2研究的意义及技术路线1.2.1研究的意义盐碱、寒冷和干旱等逆境环境对植物生长发育的影响具有重耍影响，并且间接关系到农业生产的质量和产量问题。改善作物的抗旱、耐盐性已经成为当今植物研究屮需解决的重要问题

8、。水资源的缺乏已成为威胁