基因功能分析的基本策略

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1、第十二章基因功能分析的基本策略转基因模型是研究基因功能的主要手段转基因生物：外源基因导入生物体表达。基因打靶：外源基因替换内源基因。基因敲除。基因敲入。基因沉默：导入特定基因，抑制内源性基因表达。第一节转基因技术转基因技术(transgenictechnology)：将外源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分裂而遗传给后代。细胞模型。转基因动物。转基因植物。一.转基因生物的意义20世纪80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。转基因生物的用途

2、：研究手段：疾病的转基因动物模型。改良动物性状：抗病性、耐寒性等。生产产品：抗体、疫苗等的生产。二、基本原理构建携带目的基因的载体。外源基因导入：将目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中。使目的基因整合到基因组中。将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中。使其发育成携带外源基因的转基因动物。基本原理供体基因受体的受精卵基本原理转基因的受精卵基本原理转基因动物基本过程上游—基因改造和载体构建中游—基因转移、胚胎移植与建系下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选1.上游—基因改造和载体构建外源

3、基因:完整的转录单位,由顺式作用元件、结构基因和转录终止信号组成。报告基因(reportergene):在表达载体中引入易于检测的提示重组体存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。动物转基因常用的载体腺病毒载体逆转录病毒载体非病毒类载体：如质粒等。2.中游—基因转移、胚胎移植与建系基因导入技术：物理、化学和生物学方法1)显微注射法（microinjection)2)胚胎干细胞法（embryonicstemcells

4、,ES细胞）3)逆转录病毒感染法4)精子载体法1)DNA显微注射法制备超量受精卵。DNA显微注射。转移注射卵到输卵管或子宫。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。DNA显微注射持卵管DNA注射针精原核卵原核DNA显微注射DNA显微注射到尚未发生核融合的受精卵的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原核大，容易辨别。线性DNA整合效率比超螺旋DNA高出数倍，因而用于显微注射的转入基因通常是去除载体序列的线状DNA。DNA显微注射法的特点DNA大小无限制，最大可达250Kb。随机整合：在染色体上整合的位点是随机的，整合的拷贝数也不一定。转入的基因有可能

5、碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。总效率较低(实际成功率1/1000)。提高显微注射DNA表达的成功率转入的外源基因要能够高效表达，最好是可以诱导表达。转入基因中应该包含有帮助提高整合效率的序列，如微卫星序列。微卫星序列微卫星序列诱导表达启动子外源基因2)胚胎干细胞法胚胎干细胞(embryostemcells,ES细胞)：可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他类型细胞的能力。ES细胞具有与胚胎细胞相似的形态特

6、征和分化特性。胚胎干细胞法分离和培养ES细胞。外源基因导入ES细胞。导入外源基因的ES细胞的子宫转移。转基因鼠的鉴定及鼠系建立。胚胎干细胞的分离和培养胚泡培养皿中分离胚泡内层细胞胰蛋白酶消化解离加饲养层细胞培养胚胎干细胞胚胎干细胞的分离和培养胚胎干细胞外源DNA的导入DNA胚胎干细胞囊胚原囊胚转基因动物磷酸钙-DNA共沉淀法逆转录病毒感染法电穿孔法微注射外源DNA的整合用于ES细胞的DNA载体一般带有定点整合元件,避免了随机整合。定点整合位点应选择在基因组内编码非必需产物的地方，以减少整合对细胞正常功能的影响。定点整合位点必须在基

7、因组的可以进行转录的地方。胚胎干细胞法的特点定点整合。ES细胞在体外培养，外源DNA导入后可用正-负选择法筛选择正确整合的ES细胞,相对较简单。目前只在小鼠身上获得成功。3）逆转录病毒感染法逆转录病毒载体的构建获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚外源DNA导入早期胚胎：获得病毒颗粒感染早期胚胎包装细胞与早期胚胎共培养感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成携带外源基因的动物。逆转录病毒感染法外源基因逆转录病毒载体逆转录病毒感染四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚嵌合小鼠纯合体小鼠逆转录病毒感染法的特点通过病毒DNA插入宿主DNA的机制，将外源目的

8、基因整合到宿主基因组，整合效率高。反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段DNA(＜10kb)。对家禽类的转基因研究有重要意义。4）精子载体法外源DNA精子卵细胞受精卵转基因动物共育法脂质体转染法电穿孔法DNA精子受精卵DNA卵细胞DNA胚胎干细胞D