溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscB基因的功能研究及vscD基因的克隆表达.pdf

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1、溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscB基因的功能研究及vscD基因的克隆表达摘要溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)作为海洋水生经济动物的主要病原之一，给水产养殖产业造成了严重危害。因此，需对溶藻弧菌病菌进行有效的防控。Ⅲ型分泌系统（TypeIIIsecretionsystem,T3SS）作为溶藻弧菌的毒力因子与其致病性关系密切，VscB蛋白和VscD蛋白是Ⅲ型分泌系统重要组成部分，可能在溶藻弧菌侵染宿主的过程发挥重要作用。本实验以溶藻弧菌T3SS的vscB和vscD基因作为研究对象，分别克隆了vscB和vscD基因，结果发现，vs

2、cB基因长为429bp，编码142个氨基酸，理论分子量为16.4kDa，pI值为5.48；vscD基因长1302bp，编码了433个氨基酸，分子量为47.9kDa，理论pI值为4.98。通过氨基酸序列同源性比对结果显示，溶藻弧菌的VscB与副溶血弧菌的蛋白相似度最高，达到91％，而溶藻弧菌的VscD与魔鬼弧菌（Vibriodiabolicus）的蛋白相似度最高，达到97％。同时分别构建了pET-28a-vscB和pET-32a-vscD原核表达载体，分别对其表达产物进行了可溶性检测，结果显示，VscB蛋白主要以包涵体的形式存在，而Vsc

3、D主要存在于上清中。分别对VscB蛋白和VscD蛋白进行western-blot分析，证实两蛋白均在大肠杆菌中成功表达。利用OverlapPCR以及同源重组技术，结合氯霉素（Cm）正向筛选和vmt基因对L-阿拉伯糖敏感性，构建了目的基因vscB无标记基因框内缺失株，同时构建了其回补株。并分别对缺失株、回补株和野生株的生物学表型进行了比较研究。结果发现，溶藻弧菌在缺失vscB基因的情况下，其生长曲线、胞外酶活性及生物膜生成能力与野生株和回补株相比并没有明显变化；vscB缺失株的泳动能力相比野生株明显减弱；通过LD50检测，发现其毒力比野生

4、株降低了23.2倍，将缺失株△vscB进行回补后，其毒力基本恢复至原有水平。可见，vscB基因与溶藻弧菌的致病能力相关。以缺失株△vscB作为免疫原，通过腹腔注射对石斑鱼进行了免疫，在免疫一个月后，再用溶藻弧菌野生株对石斑鱼进行攻毒。结果发现，受免疫的石斑鱼抗病能力明显增强，相对免疫保护率达到77.6％。表明缺失株△vscB可作为防治溶藻弧菌病的减毒活疫苗，具有一定的应用前景。关键词：溶藻弧菌，Ⅲ型分泌系统，vscB，基因敲除ICloningandexpressionofvscDgeneandstudyonthefunctionofvs

5、cBgeneintypeIIIsecretionsystemofVibrioalginolyticusAbstractVibrioalginolyticusisoneofthemajorpathogensofmarineaquaticanimalsandVibriosis,ithascausedseriousdamagetotheaquacultureindustryintheworld.Therefore,effectivecontrolofVibrioalginolyticusisofimportance.ThetypeIIIsec

6、retionsystemofVibrioalginolyticusiscloselyrelatedtoitspathogenicityasavirulencefactor.VscBproteinandVscDproteinareimportantcomponentsoftypeIIIsecretionsystem,anditisspeculatedthattheymayplayanimportantroleintheprocessofinvadingthehost.vscBandvscDgenesofV.alginolyticusT3S

7、SwerestudiedandvscBandvscDgeneswerecloned.TheresultsshowedthatthevscBgenehasalengthof429bpandencodes142aminoacidswithatheoreticalmolecularweightof16.4kDaandapIvalueof5.48.ThevscDgeneis1302bpinlengthandencodes433aminoacidswithamolecularweightof47.9kDaandatheoreticalpIvalu

8、eof4.98.TheaminoacidsequencehomologycomparisonresultsshowedthattheVscBofvibrioalginolyticushadthehighes