副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因的克隆、表达及表达蛋白的复性和功能的研究

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1、第一军医大学硕士学位论文副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因的克隆、表达及表达蛋白的复性和功能的研究姓名：李志峰申请学位级别：硕士专业：流行病学指导教师：聂军20030520副溶血弧菌不耐热溶血毒素的克隆、表达、复性及功能的研究缩略语AmpbpdATPdH20ddH20DNAdNTPDMSoDTTDABEBEcoliEDTAELISAhhis·tagHRPIPTGKDaLBrainmlODPBSPCRRNaserpmSDSSDS．PAGESeeTAE英文全称缩略语词汇表ampieillinBasepairsDeoxyadenosinetripHospHateDistilledwaterDoubledi

2、stilledwaerDeoxyribonucleicacidisDeoxyribonueleosideTripHospHateDimethylsulpHoxidedithiothreitoldiamimobenzidineEtllidiumbromideEscherich缸coliEthylenediaminotelraaceticacidEnzyme—linkedimmuneosorbentassayhourhistidine’tagHorseradishperoxidaseIsopropylthio—B-D-galactosidKilodaltonLuria-Bertanimediumm

3、inuteilliliterOpticaldens酊pHospHate-bufferedsalinePolymemechainreactionribonueleaseRevolutionsperminuteSodiumdodecylsulfatePolyacrylamidgelelectropHoresissecondtris／aceticaeid，EDTA-ixIa2中文全称氨苄青霉素碱基对脱氧腺苷三磷酸单蒸水双蒸水脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷三磷酸二甲基亚砜二巯基苏糖醇二氨基联苯胺溴化乙锭大肠杆菌乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验小时组氨酸标记辣根过氧化物酶异丙基一B—D-硫代半乳糖苷干道尔顿LB培

4、养基分钟毫升光密度磷酸盐缓冲液聚合酶链反应核糖核酸酶每分钟转数十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳秒Tris一醋酸一EDTA缓冲液第一军医大学硕士论文TDHThermostabledirecthcmolyticusTE仉s，EDTA-Na2TE^d匝DN，N，N’，N’一tetramcthylTLHThennolabilehemolysinTMB3,3’5，5’-tctramcthylbenzidineTRHTdh-relatedhemolysinTrisnihydroxymethylamino-methanceUlmicroliterX-gal5-brom04．c1110ro．3．indolyl

5、．B-D-galactosideVPB—M哐Vibrioparahaemolyticus2--mercaptoethan01．2．耐热的直接溶血毒素Tris—EDTA缓冲液N，N，N’，N一四甲基乙二氨不耐热溶血毒素3，3’5，5'-四甲基联苯胺相对耐热的直接溶血毒素三羟甲基氨基甲烷微升5一溴一4一氯一3一哼I哚一B_D一半乳糖苷副溶血弧菌B一巯基乙醇副溶血弧菌不耐热溶血毒素的克隆、表达、复性及功能的研究副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因的克隆、表达及表达蛋白的复性和功能的研究(中文摘要)硕士研究生：李志峰导师：聂军研究背景：副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus，Vp)是一种嗜盐

6、性弧菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病，副溶血弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒占的比例很高，发病呈世界性分布，并呈上升趋势，我国沿海地区每年都有因副溶血弧菌引起食物中毒的报道。目前研究认为副溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，不耐热溶血毒素(thermolabilehemolysin，TLH)是其产生的毒素之一，研究表明副溶血弧菌无论是临床分离株，还是环境分离株都含有tlh基因，且具有种属特异性，国外研究利用tlh基因对副溶血弧菌进行监测和检测，但对其功能和致病性研究的相对较少，国内未见相关研究报道，目前对TLH的功能和致病性仍不清楚。研究目的：本研究旨在利用编码TLH毒素

7、的tlh基因在副溶血弧菌存在的广泛性和种属特异性，克隆tlh基因，构建原核融合表达载体，纯化获得具有生物活性功能的TLH，对其功能、致病性和免疫原性等方面进行研究。研究方法：1．以副溶血弧菌国内标准株Vpl4—90基因组DNA为模板，扩增uh基因，构建克隆载体pGEM．tlh，酶切及PCR分析鉴定。2．将PCR产物tlhl4．90进行序列测定，利用Internet国际互联网上的有关生物信息网站对t