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1、创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定作者：魏杰作者单位：兰州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，甘肃兰州【摘要】冃的：构建创伤弧菌溶血素基因(vvc)的融合表达载体，并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达.方法：用一对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA中钓取vvc基因，TA克隆后测定核甘酸序列，构建pET32a(+)-vvc融合表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达，表达产物行SDSPAGE并进行WesternBlot鉴定.结果：构建了pET32a(+)vvc融合表达载体，DNA测序证明，获得的vvc基因长度为1311bp,与GenBank中报道的创伤
2、弧菌溶血素基因序列完全一致.SDSPAGE分析表明,vvc融合蛋口Mr为71X103,其表达量约占菌体总蛋白的32%.Westernblot结果显示，0的蛋白可与创伤弧菌免疫后的小鼠血清特异性结合.结论：成功地实现了VVC基因在大肠杆菌中的高效表达，为进一步研究vvc蛋白的生物学功能奠定基础.【关键词】弧菌，创伤，溶血素类，基因表达0引言创伤弧菌(Vibriovulnificus,Vv)自然存在于近海和海湾的海水和海底沉积物中[1],人体感染后病情发展迅速，最终发展为感染性休克、多器官衰竭而死亡，死亡率高达70%[2].创伤弧菌溶血素(Vibriovulnificuscytolysin,
3、vvc)的活性高达81000溶细胞单位(HU/mg),给实验小鼠尾静脉注射毫克级以下水平的vvc就可以引发死亡［3］.体外实验研究表明，vvc对肥大细胞［4］、红细胞［5］等哺乳动物的细胞都可以产生显著的细胞毒性作用，但其确切的致病机制还不十分清楚.本研究构建了pET32a(+)vvc原核表达系统，采用创伤弧菌全菌抗体对融合蛋白进行鉴定，为今后创伤弧菌快速诊断试剂盒的制备及VVC基因表达调控机理和功能研究奠定基础.1材料和方法1.1材料1.1.1菌种、载体与实验动物创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌为海军总医院检验科实验室保存菌种;大肠杆菌DH5A、BL21(DE3)、原核表达载体pET3
4、2a(+)以及BALB/c小鼠均來自木实验室.1.1.2工具酶与主要试剂PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶冋收试剂盒、溶菌酶Lysozyme、DNA和蛋白质Marker均为北京天根试剂公司产品;限制性内切酶BamHI和HindIII、T4DNA连接酶和pGEMTEasy购于Promega公司.1.2方法1.2.1细菌活化将创伤弧菌菌株按1：100接种于预先预热至37°C的LB培养基中，37°C220r/min振摇培养6h,以待备用.1.2.2模板制备取1.5mL活化菌液于13000g离心2min,彻底倒尽上清液，用双蒸水洗涤一次，13000g离心2min,去上清,将菌体悬浮，盖上盖子，在
5、沸水中煮5min,13000g离心5min,将上清储存在-20°C,取2~4ML进行PCR.123引物设计根据GenBank公布的创伤弧菌VVC基因核昔酸序列和内切酶图谱分析结果口行设计含有合适内切酶位点的特异性引物・vvc引物序列：上游5’CGCGGATCCCAAGAATATGTGCCGATTGTT3’(BamHI),下游5'CCCAAGCTTGAGTTTGACCTGTTGTAATGT3'(HindIII),送上海生工生物公司合成.1.2.4PCR反应PCR反应总体积为25ML,引物浓度为10Mmol/L,50ngDNA模板・PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s
6、;58°C复性45s;72°C延伸1min共30个循环;72°C继续延伸10min•待反应结束后，取5ML扩增产物于10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.1.2.5vvc基因的纯化与回收按照DNA胶回收试剂盒操作说明，从琼脂糖电泳中将目的条带切下，用胶冋收试剂盒冋收纯化PCR产物.1.2.6TA克隆、测序与表达载体的构建应用TA克隆试剂盒，将扩增的目的片断克隆至pGEMT载体，转化于E.coliDH5A感受态细胞中37°C过夜培养，在平板上挑取单个菌落，进行PCR鉴定，获得满意测序结果后，通过质粒提取试剂盒小量制备质粒pGEMTvvc和pET32a(+),利用BamHI和Hindlll
7、分别进Jiff行双酶切，回收酶切产物，在T4DNA连接酶作用下将vvc基因酶切片段与pET32a(+)酶切产物16°C连接过夜，构建重组质粒pET32a(+)vvc,连接后转化于E.coliBL21(DE3),扩增、提取质粒进行双酶切后再次测序，测序结果用NCBI中的Blast软件分析.127重组质粒pET32a(+)vvc在大肠杆菌中的诱导表达挑取经酶切鉴定的原核表达质粒pET32a(+)vvc单菌落，培养至A600nm=0.5时
